Жан-Пьер Башелри, Джон Ф. Томпсон, Морис Р. Вегнез, Джон Э. Херст

Исследование нуклеиновых кислот , том 9, выпуск 9, 11 мая 1981 г., страницы 2207–2222, https://doi.org/10.1093/nar/9.9.2207

• Передняя Материя
• Содержание
• Назад Материя

Все выпуски

Передовая статья: Синтетические нуклеиновые кислоты для расширения генетических кодов и исследования живых клеток

Синтетическая биология — это новая и развивающаяся дисциплина, которая включает разработку и создание новых биологических зондов и объектов, таких как ферменты, генетические цепи или синтетические клетки со сконструированными или расширенными биологические функции. Область синтетической биологии, разработанная в результате революционных биотехнологий, таких как высокопроизводительный синтез ДНК, быстрое секвенирование генома, а также подходы направленной и непрерывной эволюции для исследования клеточных функций на самом базовом уровне, включая изменение последовательностей нуклеиновых кислот. и белков в живых клетках. Переписывание или перепрограммирование существующих биологических систем для производства дизайнерских белков и полимеров нуклеиновых кислот является основным направлением синтетической биологии.

В этом специальном выпуске Frontiers in Bioengineering and Biotechnology собраны разнообразные и передовые приложения синтетической биологии. В работе подчеркивается полезность, адаптивность и инновационный потенциал РНК, в том числе инженерных или синтетических РНК, в раскрытии биологии на молекулярном уровне. Применение этих технологий синтетических нуклеиновых кислот охватывает несколько фундаментальных областей синтетической биологии, включая расширение генетического кода и новые флуоресцентные зонды для наблюдения за ошибками в синтезе белка или активности микроРНК в живых клетках.

Расширение генетического кода с помощью клеток и без них

Некоторые из исследований, представленных в этом специальном выпуске, посвящены расширению генетического кода. Эта область включает в себя ряд методов, которые позволяют синтезировать белок с дополнительными или неканоническими аминокислотами (ncAA), помимо стандартных 20 строительных блоков аминокислот, обычно используемых в синтезе белка. В целом, исследования в этой области привели к ошеломляющему набору различных химических функций, которые находят применение в сайт-специфическом мечении белков с помощью флуоресцентных или реактивных зондов, а также в модификациях белков, таких как запрограммированное фосфорилирование или ацетилирование. Действительно, в качестве введения в эту область Chung et al. предоставил проницательный обзор многих приложений расширения генетического кода, выделив исследования, которые биохимически характеризуют специально меченые или модифицированные белки.

Пирролизил-тРНК-синтетаза (PylRS) представляет собой природный фермент некоторых анаэробных архей и бактерий, который использовался для включения > 50 различных ncAA в белки, обзор Wan et al. (2014). Цзян и др. продвинули фермент еще дальше и получили сконструированный мутант PylRS с повышенной активностью и способностью включать дополнительные ncAA, включая аналоги гистидина и цистеина, которые находят применение в белковой инженерии и исследованиях функции белка.

Преодолев барьеры синтетической биологии, связанной с живыми клетками, Cui et al. рассмотрели передовые бесклеточные методы синтеза белка с использованием нескольких различных NCAA. Бесклеточные подходы позволяют производить дизайнерские белки с расширенной палитрой NCAA, которые включают различные химические функции или необычные скелеты (β-аминокислоты или α-гидроксикислоты), в том числе те, которые могут быть токсичными для клеток. Используя бесклеточную систему, Xiao et al. разработали новый подход к созданию синтетических белков с сайт-специфическими модификациями с использованием флексизима. В методе используется флексизим, представляющий собой фермент нуклеиновой кислоты или рибозим, который аминоацилирует транспортные РНК (тРНК) с желаемой неканонической аминокислотой (нкАК). Авторы продемонстрировали синтез гистонов с сайт-специфическим ацетилированием лизина или включением негидролизуемого аналога тиоацетиллизина для изучения гистонового кода.

Наконец, McKenna et al. использовали расширение генетического кода для создания специфически фосфорилированных форм онкогенной киназы AKT1 (рис. 1А). Система основана на сконструированной транспортной РНК (тРНК) (Hohn et al., 2006), которая специфически распознается фосфосерил-тРНК-синтетазой (SepRS) для переназначения кодонов UAG на фосфосерин. Авторы получили активные варианты киназы для проверки предполагаемых субстратов AKT1 (Balasuriya et al., 2020), которые представляют собой новые мишени для ингибирования AKT1-зависимого онкогенеза.

Рисунок 1 . Синтетические и сконструированные РНК для расширения генетического кода и исследования живых клеток. На схеме показаны некоторые из инновационных технологий, описанных в этом специальном выпуске. К ним относятся сконструированные транспортные РНК (тРНК ^{, сентябрь} ) для расширения генетического кода и применения, такие как производство активных киназ человека (A) . Кроме того, в этом специальном выпуске освещаются новые репортеры активности РНК, в том числе репортеры зеленого флуоресцентного белка, чувствительные к тРНК-зависимому неправильному включению аминокислот (B) или активность микроРНК (C) .

Флуоресцентные репортеры живых клеток для неправильного перевода и подавления генов

Chen et al. разработали новый флуоресцентный репортер (рис. 1В) для наблюдения и количественной оценки ошибок в синтезе белков в живых клетках. Эта технология позволила изучить редактирующую дефектную тРНК-синтетазу, которая производит как правильно аминоацилированные, так и неправильно аминоацилированные виды тРНК, что приводит к неправильной трансляции в бактериальных клетках.

МикроРНК представляют собой встречающиеся в природе малые некодирующие РНК, которые связываются с определенными информационными РНК (мРНК) для подавления активности генов. Хотя способность микроРНК регулировать экспрессию генов, в том числе онкогенов, хорошо известна, подходов к измерению активности микроРНК часто не хватает. Сиддика и Хайнеманн рассмотрели новую и развивающуюся область, посвященную конструированию белков-репортеров и новым методам обнаружения и количественной оценки активности, локализации и количества микроРНК (рис. 1С). Например, секвенирование РНК следующего поколения может выявить неизвестные микроРНК, а флуоресцентные зонды микроРНК могут измерить уровень активна , а не общая микроРНК в живых клетках (Turk et al., 2018).

Способность точно управлять экспрессией генов важна для определения того, как функционируют генные продукты, и для разработки генетических цепей для синтетической биологии. Действительно, микроРНК также вдохновили на использование синтетических РНК для подавления экспрессии генов. РНК-интерференция (РНКи) — это технология, позволяющая целенаправленно подавлять определенные мРНК с помощью комплементарных последовательностей. Поскольку сайленсинговые РНК (siRNAs) обычно продуцируются в виде дуплекса, противоположная или пассажирская цепь обладает значительным потенциалом для сайленсинга нецелевых генов. Шэн и др. рассмотрели новые подходы к снижению нецелевого молчания генов с использованием одноцепочечных миРНК.

Подводя итог, здесь мы выделили инновационные подходы, включающие инженерные или синтетические технологии на основе нуклеиновых кислот для расширения генетического кода дополнительными аминокислотами или для наблюдения или управления активностью различных видов РНК в живых клетках. Мы ожидаем, что исследования, содержащиеся в нашем специальном выпуске, вдохновят нас на новые технологии РНК для применения в биомедицинских исследованиях и синтетической биологии.

Вклад авторов

Все перечисленные авторы внесли существенный, непосредственный и интеллектуальный вклад в работу и одобрили ее для публикации.

Финансирование

Работа в лабораториях авторов была поддержана грантами Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (04282-2014 до PO’D), Канадского фонда инноваций (229917 до PO’D), Исследовательского центра Онтарио Фонд (от 229917 до PO’D), Канадские исследовательские кафедры (от 232341 до PO’D), Канадские институты медицинских исследований (от 165985 до PO’D), Канадский совет по естественным наукам и инженерным исследованиям (04776-2014 до IH), Министерство исследований и образования Онтарио (ER-18-14-193 для IH), Канадская сеть редких заболеваний: модели и механизмы (F19-00472 для IH) и Национальный институт общих медицинских наук (P20GM139768 для CF и R15GM140433 для CF).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы особенно благодарны каждому из авторов за их вклад в виде оригинальной исследовательской статьи или вдохновенного обзора последних достижений в этой теме исследования.

Ссылки

Balasuriya, N., Davey, N.E., Johnson, J.L., Liu, H., Biggar, K.K., Cantley, L.C., et al. (2020). Зависимая от фосфорилирования субстратная селективность протеинкиназы B (AKT1). Дж. Биол. хим. 295, 8120–8134. doi: 10.1074/jbc.RA119.012425

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Хон, М. Дж., Парк, Х. С., О’Донохью, П., Шницбауэр, М., и Солл, Д. (2006). Возникновение универсального генетического кода, запечатленного в записи РНК. Проц. Натл. акад. наук США 103, 18095–18100. doi: 10. 1073/pnas.0608762103

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Турк М. А., Чанг С. З., Манни Э., Жуковски С. А., Инженер А., Бадахши Ю. и др. (2018). Репортер активности miRAR-миРНК для живых клеток. Гены 9:305. doi: 10.3390/genes9060305

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Ван В., Тарп Дж. М. и Лю В. Р. (2014). Пирролизил-тРНК-синтетаза: обычный фермент, но выдающийся инструмент расширения генетического кода. Биохим. Биофиз. Acta 1844, 1059–1070. doi: 10.1016/j.bbapap.2014.03.002

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Ключевые слова: РНК, синтетическая биология, расширение генетического кода, флуоресцентные белки, РНКи, микроРНК, тРНК, неканонические аминокислоты. Кислоты для расширения генетических кодов и исследования живых клеток. Фронт. биоинж. Биотехнолог. 9:720534. дои: 10.3389/fbioe.2021.720534

Поступила в редакцию: 04 июня 2021 г.