Впр работы 2 класс: ВПР по математике 2 класс 2020 Крылова

Содержание

ВПР по математике 2 класс 2020 Крылова

ВПР по математике за 2 класс 2020 года О.Н. Крылова (10 вариантов) — вариант 1

При написании данной работы «ВПР по математике 2 класс 2020 Крылова — вариант 1» было использовано пособие «Математика. Всероссийская проверочная работа. 2 класс. Типовые тестовые задания. ФГОС О.Н. Крылова. 2020 год».

Часть 1

Задание 1

Запиши число, в котором 6 десятков и 4 единицы.

Решение

6 десятков = 60

4 единицы = 4

60 + 4 = 64

Ответ:

Задание 2

Вычисли 60 — 14.

Решение

60 — 14 = 46

Ответ:

Задание 3

Запиши числа, которые меньше данных на 1 десяток.

14, 70, 31, 82

Решение

1 десяток = 10. Меньше, значит от каждого числа отнимаем 10:

14 — 10 = 4

70 — 10 = 60

31 — 10 = 21

82 — 10 = 72

Ответ:

4, 60, 21, 72

Задание 4

Сравни значения выражений.

18 — 2 + 2 (?) 19 -2 +2

Решение

чтобы сравнить обе стороны выражения, мы должны вычислить значение каждой:

18 — 2 + 2 = 18

19 -2 +2 = 19

18 < 19

18 — 2 + 2 < 19 -2 +2

Задание 5

Запиши в порядке уменьшения.

15 мин, 15 ч, 51 мин

Решение

Минуты меньше, чем часы, поскольку в 1 часе содержится 60 минут. Значит самое большое число здесь 15 ч

Сравнить минуты между собой совсем просто

15 < 51

Получаем,

15 ч, 51 мин, 15 мин

Ответ:

15 ч, 51 мин, 15 мин

Задание 6

Реши задачу. Запиши ответ.

Рабочие выложили плиткой сначала 30 м пешеходной дорожки, а затем ещё 45 м. Сколько метров пешеходной дорожки выложили плиткой рабочие?

Решение

В задаче говорится о том, что сначала рабочие выполнили одну часть работы, а затем другую. Чтобы узнать сколько рабочие сделали всего, нужно обе части сложить.

30 + 45 = 75 (м) — пешеходной дорожки выложили плиткой рабочие

Ответ:

75 м

Задание 7

Выполни необходимые измерения и вычисли периметр прямоугольника.

Решение

Работа выполняется при помощи линейки самостоятельно.

Ответ:

18 см

Задание 8

Реши задачу. Запиши ответ.

27 пряников разложили на блюдца по 3 пряника. Сколько понадобится блюдец?

Решение

Имеем 27 пряников

Нужно разложить по 3 пряника, то есть разделить на 3

27 : 3 = 9 (б)

Ответ:

Понадобится 9 блюдец

Задание 9

Часы отражаются в зеркале. Который сейчас час?

Решение

Как видим, на часах ровно 03:00 (3 часа) или 15:00 (15 часов) — зависит от времени суток

Часть 2

Задание 10

Реши задачу.

Буратино купил курточку за 25 сольдо и две одинаковые картофелины. Сколько сольдо стоила одна картофелина, если на всю покупку потратил 31 сольдо?

Решение

Стоимость куртки — 25 сольдо

Стоимость картофеля — ?

Всего потрачено — 31 сольдо

Сначала узнаем сколько стоили две картофелины. Для этого от всех потраченных денег отнимем стоимость куртки.

31 — 25 = 6 (с) — стоимость двух картофелин

Теперь найдем стоимость одной картофелины

6 : 2 = 3 (с) — стоимость одной картофелины

Ответ:

одна картофелина стоила 3 сольдо

Задание 11

Реши задачу.

Тетрадь на 10 р. 50 к. дороже, чем полтетради. Сколько стоят две такие тетради?

Решение

В условии говорится о том, что тетрадь стоит на 10 р. 50 к. дороже, чем полтетради. Полтетради — это ровно половина целой тетради, значит стоимость каждой половинки одинаковая. Получаем:

10,50 * 2 = 21 (р) — стоимость целой тетради

или

10 р. 50 к. + 10 р. 50 к. = 21 р

Теперь вычислим какова стоимость двух таких тетрадей:

21 * 2 = 42 (р) — стоимость двух таких тетрадей

Ответ:

стоимость двух таких тетрадей 42 рубля

Навигация по записям

ВПР по русскому языку 2 класс 2020-2021 Вариант 1

ВПР по русскому языку за 2 класс 2020-2021 года А.

Ю. Кузнецов — Вариант 1

При написании данной работы «ВПР 2 класс русский язык 2020-2021. Вариант 1» использовалось Учебное издание «Всероссийская проверочная работа. Русский язык: 2 класс: 10 вариантов. Типовые задания. ФГОС / А.Ю. Кузнецов, 2020-2021 год»

Задание 1

Внимательно прочитайте и спишите текст.

Я часто выхожу гулять в парк. Там живёт белка. На высокой ёлке у белки дом. Положу в карман орехи. Угощу её. Я хочу показать пушистую белку Насте. Она любит животных.

Задание 2

Расставь по алфавиту и запиши в алфавитном порядке данные слова

хлеб, молоко, фрукты, овощи, напитки

Показать ответ

молоко, напитки, овощи, фрукты, хлеб

Задание 3

Подчеркните слова, в которых первая буква обозначает звонкий согласный звук.

Часы, шёлковый, гвоздь, блестеть, прямой.

Показать ответ

Гвоздь, блестеть.

Задание 4

Подчеркни слова, в которых первая буква обозначает мягкий согласный звук.

Ветер, буря, дождь, ливень, шторм.

Показать ответ

Ветер, ливень.

Задание 5

Раздели слова на слоги. При делении слов на слоги используй вертикальную линию.

Поход, упал, обои, любовь.

Показать ответ

По|ход, у|пал, о|бо|и, лю|бовь

Задание 6

Запиши только те слова, которые можно разделить для переноса. Обозначь место переноса чёрточкой (например, не-бо).

Поход, упал, обои, любовь.

Показать ответ

По-ход, лю-бовь

Задание 7

Составь предложение из данных слов. Запиши его правильно.

На, яркие, светят, улице, фонари

Показать ответ

На улице светят яркие фонари.

Яркие фонари светят на улице.

Если в процессе выполнения работы обучающийся допустит орфографические и/или пунктуационные ошибки на не изучаемые в начальной школе правила, то такие ошибки учитываться не будут.

Навигация по записям

ВПР 2 класс русский язык 2020-2021.

Вариант 9 (с ответами)

ВПР по русскому языку за 2 класс 2020-2021 года под редакцией Е.В. Волковой — Вариант 9

При написании данной работы «ВПР 2 класс русский язык 2020-2021. Вариант 9

» использовалось Учебное издание «Русский язык, Всероссийская проверочная работа 2 класс, Типовые задания, ФГОС / Е. В. Волкова, А. В. Птухина, 2020-2021 года»

Вариант 9 содержит 7 заданий. На выполнение заданий отводится 45 минут.
При выполнении работы не разрешается пользоваться учебником, рабочими тетрадями или другими справочными материалами.
При необходимости можно пользоваться черновиком. Записи в черновике проверяться и оцениваться не будут.

Задание 1

Внимательно прочитайте и спишите текст.

Котята

У кошки Мурки родились котята. Малыши были настоящими шалунами. Мы решили отдать их в добрые руки. Я написал объявление. Одного котёнка взяла соседка. Другого забрал мой друг.

Задание 2

Расставь по алфавиту и запиши в алфавитном порядке данные слова

скала, яма, гора, валун, ущелье

Показать ответ

валун, гора, скала, ущелье, яма

Задание 3

Подчеркните слова, в которых первая буква обозначает глухой согласный звук.

Цапля, ласточка, грач, страус, зимородок.

Показать ответ

Цапля, страус.

Задание 4

Подчеркни слова, в которых первая буква обозначает твёрдый согласный звук.

Пенал, ручка, кисточка, бумага, линейка.

Показать ответ

Ручка, бумага.

Задание 5

Раздели слова на слоги. При делении слов на слоги используй вертикальную линию.

Коза, лошадь, осёл, овца.

Показать ответ

Ко|за, ло|шадь, о|сёл, ов|ца.

Задание 6

Коза, лошадь, осёл, овца.

Показать ответ

Ко-за, ло-шадь, ов-ца.

Задание 7

Составь предложение из данных слов. Запиши его правильно.

сверкнула в яркая молния небе

Показать ответ

В небе сверкнула яркая молния.

Яркая молния сверкнула в небе.

Если в процессе выполнения работы обучающийся допустит орфографические и/или пунктуационные ошибки на не изучаемые в начальной школе правила, то такие ошибки учитываться не будут.

Навигация по записям

ВПР 2 класс математика 2020-2021. Вариант 2 с решением и ответами

ВПР по математике за 2 класс 2020-2021 года Е.В. Волковой, С.В. Бахтина — вариант 2

При написании данной работы «ВПР по математике 2 класс Волкова 2020-2021 — вариант 2» было использовано пособие «Всероссийская проверочная работа (ВПР) по математике 2 класс. 10 вариантов. Практикум по выполнению типовых заданий. Е.В. Волкова, С.В. Бахтина 2020-2021 год».

Задание 1

Вычисли 73 — 70.

Решение

73 — 70 = 3

Ответ:

Задание 2

Найди значение выражения 4 * 10 — 1 * 15.

Решение

4 * 10 — 1 * 15 = 40 — 15 = 25

Ответ:

Задание 3

Саша и Толя согнули геометрические фигуры из проволоки. У Саши получился пятиугольник с равными сторонами, а у Толи — шестиугольник с равными сторонами? Рассмотри рисунок. На сколько сантиметров кусок проволоки у Саши был короче, чем у Толи?

Решение

Длина проволоки равна периметру фигур, значит:

Периметр пятиугольника равен: 3 * 5 = 15 (см)

Периметр шестиугольника равен: 3 * 6 = 18 (см)

18 — 15 = 3 (см)

Ответ:

Кусок проволоки у Саши был на 3 сантиметра короче, чем у Толи

Задание 4

Тане, Наташе и Полине вместе 38 лет. Сколько лет будет девочкам вместе ровно через год?

Решение

Через три года каждый ребенок повзрослеет на 1 год, то есть к текущей сумме прибавится 3 года:

38 + 3 = 41 (год)

Ответ:

41 год

Задание 5

Дорисуй фигуру так, чтобы получился квадрат.
Вычисли периметр получившегося квадрата, если длина одной клетки 1 см

Решение

Одна сторона квадрата уже нарисована и равна 5 клеткам, значит все остальные стороны тоже буду равны 5 клеткам. Дорисовываем.

Периметр квадрата равен: 5 + 5 + 5 + 5 = 20 (см.)

Ответ:

Периметр равен 20 сантиметров.

Задание 6

Дедушка пришел в поликлинику на прием к врачу. На первом этаже висит стенд с указанием номеров кабинетов, в которых принимают специалисты.

Специалист	Этаж	Номер кабинета
Хирург	3	321
Терапевт	4	401
Окулист	2	214

В каком кабинете принимает окулист? — 214 кабинет
На каком этаже находится кабинет хирурга? — 3 этаж

Задание 7

Сколько времени пройдет до полуночи, если сейчас часы показывают 23:25?

Решение

Полночь наступает в 24:00 (или 00:00)

24:00 — 23:25 = 00:35

Ответ:

35 минут

Задание 8

Лена разместила в альбоме 16 наклеек с городами России, 21 наклейку с животными и ещё несколько наклеек с цветами. Сколько у Лены наклеек с цветами, если всего в альбоме 57 наклеек?

Решение

16 + 21 = 37 (н.) — всего наклеек с городами России и животными

57 — 37 = 20 (н.) — наклеек с цветами

Ответ:

20 марок

Задание 9

Найди закономерность и восстанови пропущенный фрагмент узора.

Задание 10

Аня считает, что вчера была пятница. Лена говорит, что пятница будет завтра, а Вика утверждает, что завтра будет воскресенье. Какой день недели сегодня, если известно, что одна девочка ошиблась в подсчётах?

Решение

Понедельник	Вторник	Среда	Четверг	Пятница	Суббота	Воскресенье
				вчера (Аня) ~~завтра (Лена)~~		завтра (Вика)

Ответ:

Из таблицы видно, что сегодня — Суббота

Навигация по записям

ВПР 2 класс русский язык 2017 год

На официальном сайте ВПР СтатГрад в середине июля 2017 года опубликован Приказ Министерства образования и науки Российской Федерации от 30 июня 2017 года № 624 «О внесении изменений в приказ Министерства образования и науки Российской Федерации от 27 января 2017 года № 69 «О проведении мониторинга качества образования»

Из которого следует, что 3 октября 2017 года во 2 классах будет проведен мониторинг качества образования в форме проверочных работ ВПР по русскому языку.

!!! Внимание срок перенесли на 12 октября (приказ)

29.08.2017 года на официальном сайте СтатГрад появились образцы (демоверсии) ВПР 2017 для 2 класса

Демоверсия ВПР 2 класс 2017 год

Демоверсия + система оценивания	скачать
Описание ВПР по русскому языку 2 класс	скачать

Варианты ВПР для 2 класса по русскому языку 2017 год (задания + ответы)

Еще документы размещенные на сайте СтатГрад относящиеся к проведению ВПР в начале учебного года:

1. Письмо приказ

2. Описание всероссийской проверочной работы по русскому языку для обучающихся 2 классов

3. Порядок проведения ВПР 2017 во 2 классах в начале учебного года

4. План график

5. Инструкции для образовательной организации по проведению всероссийских проверочных работ в октябре 2017 года.

В инструкции интересен пункт 1: «Расписание всероссийских проверочных работ (ВПР), включая время публикации всех видов материалов, размещается в личном кабинете образовательной организации (ОО) на портале сопровождения ВПР www. eduvpr.ru не позднее, чем за 3 дня до даты проведения работы.»

Варианты ВПР 2 класс по русскому языку — задания с ответами 2016 год

Смотрите также:

Описание ВПР по русскому языку 2 класс

Всероссийская проверочная работа (ВПР) по русскому языку проводится в целях мониторинга качества подготовки обучающихся 2 классов. Мониторинг направлен на обеспечение эффективной реализации государственного образовательного стандарта начального общего образования.

Задания диагностической работы направлены на выявление уровня владения обучающимися базовыми предметными правописными и учебно-языковыми фонетическими и синтаксическими умениями, а также универсальными учебными действиями.

Задание 1 проверяет умение обучающихся безошибочно (без пропусков и искажений букв) и аккуратно списывать предложения неосложненного текста. Успешное выполнение задания опирается на навык чтения (адекватное зрительное восприятие информации, содержащейся в предъявляемом тексте) как одного из видов речевой деятельности. Наряду с предметным умением проверяется сформированность регулятивных универсальных учебных действий (адекватно самостоятельно оценивать правильность выполнения действия и вносить необходимые коррективы – осуществлять самоконтроль).

Задание 2 предполагает знание букв русского алфавита и их последовательности, проверяет умение обучающихся пользоваться алфавитом для упорядочивания слов, проверяет владение познавательным универсальным учебным действием – использование алфавита для поиска нужной информации в словаре.

Задание 3 проверяет умение опознавать согласные звуки по глухости–звонкости в слове (учебно-языковое опознавательное умение).

Задание 4 проверяет умение опознавать согласные звуки по мягкости– твердости в слове (учебно-языковое опознавательное умение).

Задание 5 предполагает анализ слоговой структуры слова, владение учебно-языковым умением делить слова на слоги; выявляет владение познавательным универсальным учебным действием – построением логической цепи рассуждений.

Задание 6 проверяет правописное умение обучающихся распознавать место переноса слова (опознавательное умение), а также владение познавательным универсальным учебным действием – построением логической цепи рассуждений.

Задание 7 проверяет учебно-языковое синтаксическое умение составлять предложение из слов, устанавливая между ними связь по вопросам, а также правописное умение употреблять прописную букву в начале предложения и ставить пунктуационный знак в конце предложения.

Помимо предметных умений, все задания предполагают проверку различных видов универсальных учебных действий: регулятивных (адекватно самостоятельно оценивать правильность выполнения действия и вносить необходимые коррективы) и познавательных (осуществлять логические операции, устанавливать причинно-следственные связи).

Текст инструктажа ВПР (Русский язык, 2 класс)

«Ребята, вам предстоит написать проверочную работу по русскому языку. В ней семь заданий. Выполнять их можно в любом порядке, постарайтесь сделать правильно как можно больше заданий.

Каждому из вас выдаются листы с заданиями (организатор показывает лист с заданиями).

При выполнении заданий можно использовать черновик. Записи в черновике проверяться и оцениваться не будут.

Перед выполнением задания внимательно прочитайте инструкцию к нему.

Если вы хотите исправить ответ, зачеркните его и напишите рядом новый.

Время выполнения работы – 45 минут. При выполнении работы нельзя пользоваться учебником, рабочими тетрадями.

Приступая к работе, будьте внимательны, не торопитесь.

Перед началом работы давайте впишем полученные вами коды на листы с заданиями. Найдите в правом верхнем углу каждого листа прямоугольную рамку со словом «Код» и впишите в эту рамку код, который вам выдан.

При выполнении работы соблюдайте порядок.

Желаем успеха!»

ВПР 2 класс «математика,русский,окружающий»

ПР 2017 г. Русский язык. Математика. Окружающий мир. 1 класс. Образец

по РУССКОМУ ЯЗЫКУ. МАТЕМАТИКЕ. ОКРУЖАЮЩЕМУ МИРУ

На выполнение интегрированой работы даётся 45 минут. Работа содержит 5 заданий. Все задания напрвлены на пропаганду безопасности дорожного движения.

В заданиях, после которых есть поле, запиши ответ.

Задание №1 прочитай три раза, перепиши, раздели на слоги, обозначь звуки и поставь ударение.

Если ты хочешь изменить ответ, то зачеркни его и запиши рядом новый.

При выполнении работы нельзя пользоваться учебниками, рабочими тетрадями, справочниками, калькулятором.

При необходимости можно пользоваться черновиком. Записи в черновике проверяться и оцениваться не будут.

Советуем выполнять задания в том порядке, в котором они даны. Для экономии времени пропускайте задание, которое не удаётся выполнить сразу, и переходи к следующему. Постарайся выполнить как можно больше заданий.

Кружок с номером задания закрась по принципу «Светофор», оценив себя после выполнения упражнения.

При выполнении заданий старайся придерживаться следующих отрезков времени:

Выполнила: Лосева Ольга Сергеевна, учитель начальных классов

Когда пешеход едет в троллейбусе, автобусе, трамвае или автомобиле, он становится пассажиром. Для пассажиров тоже придуманы правила, которые они должны выполнять, чтобы проезд в транспорте был для всех безопасен.

Реши примеры и впиши букву в клетку, соответствующую ее числу.

В результате решения примеров ты получешь ключевое слово. Отметь возле каждого решеного задания кружок соответсвующего цвета. Не забудь закрасить кружок в 1 задании.

14+4=…Е
10+5=…Т
4+12=…В
15-2=…Ф
19-5=…Р
7-2=…О
12+7=…С

Код

Реши задачу. Не забудь закрасить кружок цветом, соответствующим твоей самооценке.

19 учащихся перешли дорогу под знаком пешеходный переход, а пятеро в удобном месте. Сколько учащихся перешли дорогу правильно? На сколько учащихся больше?

Подумай. Запиши ответ. Закрась кружок самооценки.

Два мальчика и три девочки вышли из школы. Когда они подошли к пешеходному переходу, зелёный сигнал уже начал мигать. Мальчики побежали через дорогу бегом, а девочки остались ждать следующего зелёного сигнала. Сколько ребят правильно перешли дорогу?

Ответ:_______________________________________________________

Выбери правильный вариант ответа. Оцени себя.

1. Какой это знак?

а) надземный пешеходный переход;

б) подземный пешеходный переход;

в) пешеходный переход.

2. Какой из этих знаков относится к группе «Запрещающие»?

а) б) в)

Код

3. Какой знак не входит в группу «Предупреждающие»?

а) б) в)

4. Знаки какой группы имеют

круглую форму с красной каймой?

а) предупреждающие;

б) предписывающие;

в) запрещающие.

5. Как располагаются

сигналы светофора?

а) красный, желтый, зеленый;

б) красный, зеленый, желтый;

в) зеленый, желтый, красный.

Код

6. Какое транспортное средство можно отнести к общественному транспорту?

а) б) в)

7. Найди номер «Скорой помощи»

а) б) в) г)

8. Можно ли ехать на велосипеде, у которого неисправны тормоза?

а) можно;

б) нельзя;

в) можно, но с маленькой скоростью.

9. Что должен делать пассажир?

а) громко разговаривать и шуметь;

б) оплатить проезд;

в) уступить место старшим,

инвалидам и пассажирам с

маленькими детьми.

Код

10. Где можно переходить улицу?

а) на перекрестке;

б) по пешеходным переходам;

в) на любом участке дороги.

11. По какой части дороги должен

ходить пешеход?

а) по тротуару;

б) по проезжей части;

в) по обочине.

12. В какие игры можно играть на

проезжей части дороги?

а) в подвижные игры;

б) в интеллектуальные игры;

в) на проезжей части нельзя играть

ВПР 2 класс 2017 год русский язык задания и ответы

Всероссийская проверочная работа (ВПР) по русскому языку проводится в целях мониторинга качества подготовки обучающихся 2 классов.

12 октября 2017 года во 2-х классах школ страны проведен мониторинг качества образования в форме проверочных работ ВПР по русскому языку.

Варианты ВПР для 2 класса по русскому языку 2017 год (задания + ответы)

Образец ВПР 2 класс 2017 год по русскому языку

Демоверсия + система оценивания	скачать
Описание ВПР по русскому языку 2 класс	скачать

На выполнение работы по русскому языку даётся 45 минут.

Работа включает в себя 7 заданий.

В рамках проверочной работы проверяется умение второклассников безошибочно и аккуратно списывать предложения неосложненного текста. Также учащиеся должны продемонстрировать умение пользоваться алфавитом для упорядочивания слов, использовать алфавит для поиска нужной информации в словаре.

Кроме того в рамках работы проверяется умение распознавать согласные звуки в слове по глухости-звонкости и мягкости-твердости, умение делить слова на слоги, распознавать место переноса слова.

Также учащимся предстоит продемонстрировать умение составлять предложение из слов, устанавливая между ними связь по вопросам, а также умение употреблять прописную букву в начале предложения и ставить пунктуационный знак в конце предложения.

При выполнении работы не разрешается пользоваться учебником, рабочими тетрадями, справочниками по грамматике, орфографическими словарями, другими справочными материалами.

При необходимости можно пользоваться черновиком. Записи в черновике проверяться и оцениваться не будут.

При оценивании ответов допущенные обучающимися орфографические и пунктуационные ошибки на не изучаемые в начальной школе правила не учитываются.

Результаты ВПР не влияют на перевод в следующий класс и на получение аттестата и нужны для:

— самооценки школ;

— выявления пробелов в знаниях учащихся;

— помощи учителям и родителям в организации работы с каждым школьником;

— мониторинга уровня образования в стране.

Таблица перевода баллов в отметки по пятибалльной шкале по ВПР для 2 класса по русскому языку.

Отметка по пятибалльной шкале	2	3	4	5
Первичные баллы	0–6	7–12	13–17	18–21

Смотрите также:

— ВПР 2 класс по русскому языку варианты заданий с ответами 2016 год

— образец ВПР 2 класс русский язык 2017 год

Слушают в классе: студенты Винуски проводят интервью о COVID Год

Не секрет, что за прошедший год пандемии учащиеся, учителя и школьный персонал испытали огромные изменения: национальный расчет по расе, президентские выборы, добавлено к обычным задачам навигации в подростковой жизни. А в средней школе Winooski около 60 учеников сделали подкаст об этом.

Подкаст под названием «Рассказывание историй во время пандемии» был детищем учителя Кейтлин МакЛауд-Блувер и других сотрудников средней школы Винуски.

«Пока мы с учителями размышляли о том, как будет выглядеть конец года, мы действительно хотели признать, что это довольно уникальный момент времени», — сказал МакЛауд-Блувер. «И просто продолжать бизнес в обычном режиме или то, что мы планировали, было не совсем подходящим для мая 2021 года».

После более чем года, когда пандемия стала фоном их жизни, Маклауд-Блувер сказал, что запись интервью дала студентам возможность запечатлеть этот конкретный момент во времени.

«Итак, мы действительно хотели дать учащимся момент, чтобы по-настоящему поразмышлять о своем собственном опыте, а также, как вы знаете, по-настоящему начать слушать своих друзей, членов сообщества, членов семьи о том, каким был для них прошедший год, » она сказала.

«Итак, мы действительно хотели дать студентам возможность по-настоящему поразмышлять о своем собственном опыте, а также, как вы знаете, по-настоящему начать прислушиваться к своим друзьям, членам сообщества, членам семьи о том, каким был для них прошедший год. «- Кейтлин Маклауд-Блувер, средняя школа Винуски,

Процесс начался в апреле и длился вплоть до последних школьных дней в июне. А законченное задание даже получило некоторую помощь в редактировании и продюсировании из Вермонтского центра народной жизни. Это так удивительно, что Центр народной жизни Вермонта помог нам создать подкаст, — сказал МакЛауд-Блувер. — Итак, в нашем подкасте есть фрагменты голоса почти каждого студента, и студенты были так впечатлены. Я имею в виду, это звучит как официальный подкаст! Им это понравилось.А потом мы также собрали все интервью, проекты или истории студентов в официальную книгу, и у нас было небольшое празднование публикации в один из последних дней школы ».

Вооруженные своими заданиями и записывающим оборудованием, ученики рассыпались веером. Ученица старшей школы Винусски Та Рэй Пе Сай взяла интервью у Энн, которая работает в Tiny Thai и Asiana Noodle House в Винуси.

«Когда я брал интервью у Энн, она так честно рассказывала мне свою историю», — сказал Пе Сай. .«И ей так комфортно. Может, она верит и доверяет мне поделиться своей историей, и это заставило меня чувствовать себя так здорово, потому что я не нервничал и не беспокоился из-за своих вопросов».

Больше из VPR: «Идеальный возраст для разговора»: познакомьтесь с 16-летней активисткой Минелле Сарфо-Аду

Студент Дон Кипута взял интервью у директора школы , и спросил: «Как вы думаете, что вы помните больше всего? о прошлом году? »

Директор Жан Бертьям сказал: «Мне просто понравилось узнавать некоторых студентов и учителей немного иначе, чем я, вероятно, иначе смог бы познакомиться с ними.«

« Когда я брал у него интервью, да, он сказал мне, что потерял обоих родителей », — сказал Кипута. -« Я был в шоке! Как ты можешь потерять обоих родителей, оставаясь сильным. И он был сильным и вдохновлял нас верить в себя и просто продолжать нашу работу и никогда не сдаваться. Несмотря ни на что ».

Студент Аюш Прадхан позвонил своему близкому другу. Они поговорили о прошедшем году и его проблемах. Он поговорил с Миланом Магаром, который был первокурсником в Champlain College в Берлингтоне.

«Что меня удивило, так это то, как тяжело ему пришлось пережить пандемию, поскольку он не мог много ходить в школу и был в сети», — сказал Прадхан. «И он сказал, что ему лучше учиться, когда он лицом к лицу с людьми. И я чувствовал это. Я такой же, как он. С тех пор я очень хорошо учусь, когда разговариваю с учителями, так как я могу получить больше помощи, чем онлайн. »

«Мне была предоставлена возможность понять людей, с которыми я беру интервью. Кроме того, я могу выразить свое мнение на основе вопросов, которые я должен задать этому человеку.»- Дон Кипута, ученик средней школы Винуски

В подавляющем большинстве студенты сказали, что люди, с которыми они беседовали, говорили о надежде скоро снова быть вместе.

» Надежда и будущее человека, с которым я беседовал, он хочет, например, поступить в колледж вернулся к нормальной жизни и хочет подружиться, потому что он новичок в колледже, и вы с нетерпением ждете друзей, учителей и других людей », — сказал Прадхан.

Кипута добавил:« Люди учатся лично, потому что ему нравится быть с людьми, и он не может дождаться следующего года.

И Пе Сай сказал: «Мол, она хочет открыть свой бизнес, например, открыть бар, кафе. И она говорит, что хочет попытаться включить некоторые рекомендации по безопасности, потому что пандемии могут случиться в любое время. Она говорит, что хочет сделать больше новых рекомендаций по безопасности, и она говорит, что хочет сосредоточиться на своей мечте открыть свой бизнес ».

Кипута сказал, что чувствует благодарность за этот проект.

« Мне была предоставлена возможность чтобы понять людей, с которыми я беру интервью », — сказал он.«Кроме того, чтобы выразить свое мнение, основанное на вопросах, которые я должен задать этому человеку».

Согласно Маклеод-Блувер, важно делать паузу и слушать студентов.

«Думаю, я пытаюсь обосновать свое обучение, как мы можем усилить голос ученика и позволить ему вести разговор?» она сказала. «И я думаю, что это была прекрасная возможность для студентов почувствовать себя опубликованными авторами и по-настоящему услышать их голоса».

Есть вопросы, комментарии или советы? Отправьте нам сообщение или напишите нам в Твиттере @vermontedition.

Мы закрыли наши комментарии. О том, как связаться с нами, читайте здесь.

«Теперь я чувствую себя гражданином»: рабочие поля помогают вермонтерам в восстановлении найти — и сохранить — работу

Working Fields — это частное кадровое агентство, которое подбирает соискателей для компаний, у которых есть рабочие места, которые нужно заполнить. Но в отличие от других кадровых агентств, «Рабочие поля» были созданы для людей, выздоравливающих от зависимости, и людей с историей убеждений.

В настоящее время они работают в пяти округах Вермонт и планируют расширение.

Независимый продюсер Эрика Хейлман побеседовала с основателем Working Fields Микки Уайлсом.

Микки Уайлс был выдающимся деятелем делового мира. Ранее он был финансовым директором Ben and Jerrys и финансовым директором Seventh Generation. Он действительно хорошо справлялся со своей работой.

У него также были проблемы с алкоголем, хотя к тому времени, когда он работал на этой работе, он не пил. Но проблемы с зависимостью вернулись по-другому, и на этот раз, по его словам, поведение, связанное с зависимостью, закончилось растратой и тюремным сроком в федеральной тюрьме.

«… Люди с более высоким социально-экономическим положением, как правило, имеют гораздо лучшие ресурсы и системы поддержки. Хотя это непросто, но у них есть более легкий путь к выздоровлению, чем у людей, переживших бедность поколений». — Микки Уайлс, основатель Working Fields

Когда Уайлс вышел, он искренне раскаялся. Он вернул все деньги и вернулся к программе восстановления.

Он также был образован, принадлежал к высшему среднему классу и имел хорошие связи.Микки Уайлс может вернуться к работе. Но в тюрьме и на стадии выздоровления он встречал много людей, которым приходилось тяжелее.

Микки Уайлс: Итак, у нас есть этот процент населения, у которого есть проблемы с зависимостью или проблемы с судимостью. Это влияет на все социально-экономические уровни. Однако люди с более высоким социально-экономическим положением, как правило, имеют гораздо лучшие ресурсы и системы поддержки. Хотя это нелегко, у них есть более легкий путь к выздоровлению, чем у людей, переживших бедность поколений, жизни, полной зависимости от психоактивных веществ, жизни, в которой они никогда не получали финансовых средств, возможностей или надлежащего образования.И хотя есть программы и социальные службы, они даже не знают, как их найти. Они не знают, как ориентироваться в системе. Их путь намного сложнее.

Больше из VPR: Как один волонтер из Шелбурна реагирует на передозировку в гостиничных домах

Существует стигма вокруг зависимости от наркотиков; есть стигма вокруг людей с убеждениями. Есть много людей, которые этого не понимают и не верят, что люди меняются.

Тогда есть группа населения, которая, возможно, хочет быть полезной и действительно хочет оказать помощь, но не знает, как это сделать. Они не знают, как нанимать людей, которые выздоравливают или имеют прошлые судимости. Они не знают, как их оценивать, измерять их успехи или оказывать им необходимую поддержку. В бизнес-школе этому не учат.

Итак, я знал, что решение заключалось в том, что если бы мы могли найти работу людей, то есть несколько атрибутов, которые действительно помогают успешному восстановлению, и занятость — один из них, потому что занятость повышает самооценку, предоставляет финансовые ресурсы, которые крайне необходимы людям, которые создали куча проблем в их жизни, и на это нужно время.Время — убийца на раннем этапе выздоровления. Итак, если вы устроитесь на работу и поддержите ее с помощью коучинга по выздоровлению, у вас внезапно появится формула успеха.

Коучинг выздоровления — это не терапия или лечение. Это больше похоже на практический лайф-коучинг для выздоравливающих людей, и они поддерживают людей с такими несоизмеримыми проблемами, как отношения или то, как добраться до DMV за лицензией или заполнение документов для курсовой работы GED — бесконечные логистические проблемы, связанные с началом новой жизни.

Многие люди, только что вышедшие из тюрьмы, пытаются найти работу через временные агентства. Но эти временные агентства не принимают людей с тяжкими преступлениями. Итак, что произойдет, если вы поддержите людей и создадите кадровое агентство, сотрудничая с компаниями, которые готовы дать людям второй шанс?

Это то, что намеревался сделать Уайлс.

Микки: Итак, я сказал: «Мы можем заполнить этот пробел, заставить людей работать так же, как они», но обращаясь к работодателям и удовлетворяя их потребности в найме, но затем поддерживая их с помощью сильного управления учетными записями и сильного коучинга по восстановлению.И это была модель, которую я разработал, построил и внедрил.

Майк Бушар боролся с зависимостью, он попадал в тюрьму и выходил из нее за продажу наркотиков. Он также изо всех сил пытается найти постоянную работу.

Больше от VPR: «Ему нужна была сигарета … Мне нужен был кто-то, с кем поговорить»: история дружбы с COVID

Майк: Как только вы говорите им, что у вас преступление, они в значительной степени говорят вам чтобы зацепить это. Вы можете довольно легко устроиться на стройку, и шансы на успех довольно малы, потому что все на рабочем месте либо принимают таблетки, либо курят марихуану, либо пьют, поэтому довольно легко вернуться к тому, кем вы были, с такой работой.

Я мог бы получить одну из этих работ; Я просто не хотел этого, потому что знал, что произойдет. Я это уже сделал. Так что, честно говоря, «Рабочие поля» в значительной степени спасли мне жизнь, потому что я, вероятно, был там, где продавал наркотики.

Микки: То, что мы делаем как коучи по восстановлению, заключается в том, что мы помогаем связать людей с соответствующими агентствами социальных услуг, но мы также помогаем им ориентироваться в этом, потому что часто они либо не обладают нужным набором навыков. А иногда это просто уровень уверенности.Человеку, находящемуся на раннем этапе выздоровления, не обязательно быть уверенным, чтобы заниматься и защищать себя.

«Теперь я чувствую себя гражданином, в некотором роде, а не помехой. Я не помеха. Дела дались нелегко — это точно. далеко.» — Майк Бушар

Это жилье, транспорт, юридические вопросы, вопросы отношений, что угодно. Вместе с ними мы смотрим на несколько различных областей.Затем мы составляем план. Мы устраиваем им работу. Мы заставляем их работать и двигаться вперед и поддерживаем их прогресс не только в работе, но и в их выздоровлении.

Майк: Когда я впервые начал работать с рабочими полями, у меня не было действительного удостоверения личности. А чтобы работать полный рабочий день, у вас должно быть действующее удостоверение личности, карточка социального страхования и свидетельство о рождении. Когда вы действительно занимаетесь полным рабочим днем, у вас, по сути, есть личность. Working Fields ручается за вас, пока у вас нет ничего из этого. Они ставят вашу ногу в дверь.

Эрика: Почему для меня важен успех этого бизнеса?

Микки: Итак, причина, по которой это должно иметь значение для всех, заключается в том, что у нас есть определенный процент населения, который будет людьми, которые по тем или иным причинам — экологическим, наследственным — предрасположены к зависимости от психоактивных веществ или их окружающая среда создали ситуацию, когда они сделали неправильный выбор, попали в криминальные ситуации.

Но, в конце концов, это люди, которые находятся в нашем сообществе, они будут здесь.У них такое же право ходить по улицам, как и у всех остальных. И если мы сможем помочь им и вывести их из этих проблем и ситуаций, то они станут полезными членами общества.

Больше из Vermont Edition: Воспитание из тюрьмы: как одна мать справляется с виртуальным посещением

Эрика: Чувствуете ли вы, что сейчас находитесь в этом мире? Когда вы в мире, чувствуете ли вы, что сейчас находитесь в обычном мире?

Майк: Ага.Я чувствую … Как вы это называете? … Я чувствую себя сообществом… человек? Я не правильно говорю…

Эрика: Гражданин?

Майк: Ага. Теперь я чувствую себя гражданином, а не помехой. Я не помеха. Дела были непростые — это точно. Но у меня было заверение. И с этим можно довольно далеко зайти.

Есть вопросы, комментарии или советы? Отправьте нам сообщение или напишите нам в Твиттере @vprnet.

Мы закрыли наши комментарии. О том, как связаться с нами, читайте здесь.

Vermont Reads: The Sound And Feel Of Poetry

В нашем гиперсвязанном мире некоторые могут обнаружить, что становится все труднее замедляться на достаточно долгое время, чтобы читать и по-настоящему наслаждаться стихотворением. Профессор Университета Вермонта поощряет своих студентов ценить звучание и ощущение стихов.

Майор Джексон говорит, что в раннем возрасте он полюбил сжатый язык как читатель стихов. Его бабушка и дедушка афроамериканского происхождения из рабочего класса хранили книги со стихами в своем доме на севере Филадельфии.Время от времени Джексон натыкался на стихотворение, которое резонировало с ним в акустическом отношении.

«Это меня никогда не покидало», — сказал 44-летний Джексон, сидя в своем офисе в кампусе Берлингтона. «Мне до сих пор нравятся слова».

Это были 1980-е, золотой век хип-хопа — время, по словам Джексона, когда ему не составляло труда перейти от Роберта Фроста к таким группам, как The Treacherous Three; время, когда чтение и написание стихов среди чернокожих, признал Джексон, многие считали «белыми». ’

« Не в моей семье », — объяснил Джексон. «Во всяком случае, грамотность была средством не спускать глаз с приза. Он просто понимал, что то, что связывает американскую культуру — будь то стихотворение в книге или уличный рэп, — это язык ».

Жизнь Джексона забрала его из Филадельфии, где он изучал бизнес в Университете Темпл, в Берлингтон, где сегодня он преподает поэзию в UVM.

В прошлом бухгалтер, теперь он редактор стихов в Harvard Review.Этой весной он получил стипендию Гуггенхайма за свою работу. Он подходит под определенный академический типаж: очки в толстой оправе, джинсы в кофейных пятнах и вельветовый пиджак. Но ясно, что любые стереотипы на этом заканчиваются, когда он сидит на углу стола и командует своим классом.

«Кто выигрывает?» — спросил он своих учеников в начале недавнего урока.

«Мы», — ответили они.

На этих семинарах Джексон пытается помочь студентам избавиться от сдержанности. В наш век цифрового одиночества он хочет, чтобы его ученики ценили звучание слов, побуждая их преодолеть беспокойство по поводу чтения своих стихов своим сверстникам.

«Я думаю, что наше поколение воспринимает поэзию как должное», — сказала Мари Стоукс, ученица из Манхэттена, которая говорит, что ей нравится писать стихи, но она пришла в этот класс, боясь поделиться ими.

«Я читаю свои стихи маме и лучшему другу перед тем, как отправить их. И я крутой, но потом я захожу сюда и говорю: «Ах, слова!» Итак, мы над этим работаем », — сказал Стоукс. «Я от природы очень застенчива и боюсь, что кому-то это может не понравиться так, как мне».

Майор Джексон говорит, что Стокс и другие студенты прошли долгий путь с начала семестра.

На протяжении всего класса его стиль общения — разговорный, он называл своих учеников «друзьями» и говорил им, что с самого первого дня он им восхищался, потому что, по его словам, в современном обществе нужно много мужества, чтобы быть выразительными.

«Нас не поощряют вдумчиво относиться к языку и думать о последствиях и эффектах языка, который мы используем», — сказал Джексон. «Я не могу вспомнить ни одной группы в нашем обществе, которая нуждается в этом больше, чем сегодняшняя молодежь».

Джексон говорит, что стихотворение — это не рекламный щит для каких-то эмоций или отличительных черт, поэтому, когда студенты попадают в водоворот университетской жизни, возможность написать стихотворение — это приглашение замедлить темп.

Он говорит, что в их повседневной жесткой рутине мало что приветствовало бы такого рода глубокие размышления.

Голуэй Киннелл

Поэт Голуэй Киннелл получил Национальную книжную премию и Пулитцеровскую премию за свои работы. Теперь он проводит большую часть своего времени в «гостиной» типичного красного фермерского дома Вермонта, где он живет со своей семьей.

Что ему приносят стихи?

«Если это стихотворение, которое я люблю, оно приносит мне огромное счастье.У поэзии есть странная древесина, которой нет в прозе. В прозе мы рассказываем о том, что произошло, в поэзии звучит чуждый нам голос, возможно, там, где произносятся самые нежные и правдивые слова. Помимо моих близких, стихи были самым важным в моей жизни », — сказал он.

Поэма Голуэя Киннелла «Св. Франциск и Свинья »включен в Поэзия 180.

Святой Франциск и Свинья

Бутон
означает все,
даже то, что не цветет ,
для всего цветов, изнутри, самосовершенствования;
хотя иногда необходимо
передать вещи ее красоту,
положить руку ей на лоб
цветка
и пересказать словами и на связи
это прекрасный
, пока он снова не расцветет изнутри, самооблагословения;
как Св.Фрэнсис
положил руку на морщинистый лоб
свиньи и сказал ей словами и на связи
благословения земли свиноматке, и свиноматка
начала вспоминать всю свою толстую длину,
от земляной морды до конца
через корм и помои до духовного завитка
хвоста,
от твердой иглы, выступающей из позвоночника
вниз через большое разбитое сердце
синему молоку, мечтательности, струящейся и дрожащей
из четырнадцати сосков в четырнадцать ртов, сосущих
и дуя под ними:
длинная, совершенная красота свиноматки.

VPR выигрывает три национальные награды в области журналистики

Подкаст, исследующий статус абенакских коренных американцев в Вермонте, и видео, в котором Lego используются для объяснения собрания в Айове, а также освещение последних новостей о скандале EB-5 Северо-Восточного Королевства выиграли Vermont Public Радио три национальных премии в области журналистики за свою работу в 2016 году.

VPR получил награду Эдварда Р. Мерроу за лучший новостной документальный фильм и превосходство в видео от Ассоциации радио и телевидения цифровых новостей (RTDNA), крупнейшей в мире профессиональной организации, занимающейся исключительно электронной журналистикой.VPR News также получил награду за последние новости от Public Radio News Director Inc. (PRNDI).

Документальный фильм «Лучшие новости»: «Каков статус коренных американцев абенаки в Вермонте сегодня?»
Каждый месяц подкаст Brave Little State отвечает на вопрос, заданный слушателем и за который проголосовало сообщество. В победившей работе был задан вопрос: «Каков статус коренных американцев абенаки в Вермонте сегодня?».

Анджела Эванси, ведущая и создательница подкаста, говорит, что модель шоу, ориентированная на людей, впервые использованная WBEZ Curious City , открыла радикально новый способ освещения.

«В случае с этой историей об абенаках из Вермонта, казалось бы, простой вопрос вызвал сложные разговоры о том, как местное сообщество видит — и не видит — себя в современном Вермонте», — сказал Эванси. «Я был так благодарен лидерам абенаков, которые открыли для меня свои дома и племенные штаб-квартиры, и доверили мне поделиться небольшой частью их истории».

Премия Мерроу за выдающиеся достижения в области видео: «Как работает собрание в Айове, за 2 минуты (в ролях Lego)»
«Как работает собрание в Айове, за 2 минуты (в главных ролях») », созданное Эванси и цифровым репортером Тейлором Доббсом , Получил награду за выдающиеся достижения в области видео. Доббс говорит, что идея родилась из-за необходимости дешево объяснить сложный предмет.

Перед отчетной поездкой VPR в Айову в 2016 году VPR попросил слушателей задать вопросы о политическом процессе в Айове. Несколько человек интересовались, как работает собрание в Айове. «Когда мы изучили это, мы обнаружили, что процесс собрания настолько сложен, что нам потребовались бы визуальные эффекты, чтобы объяснить его», — сказал Доббс.

Они хотели нанять аниматора для создания видео, но когда пришла оценка слишком высоко, Доббс и Эванси взяли дело в свои руки.

«Мы вытащили плакатную бумагу из конференц-зала и убрали со стола офисный принтер, где построили небольшой фон», — сказал Эванси. «Мы позаимствовали Lego из детских коллекций наших коллег — президент VPR Робин Тернау внес действительно отличный вклад, как и наш инженер Джон Биллингсли».

Доббс сказал, что он был ошеломлен положительной реакцией на видео, но один отзыв выделился.

«Я слышал от своего учителя обществоведения в старшей школе в Монпелье, что он использовал видео для запуска классного проекта, и именно тогда я почувствовал, что мы действительно попали в цель.Приятно слышать от людей, что теперь они лучше понимают систему собраний или что наше видео вдохновило на дальнейшее взаимодействие. Вот почему мы на самом деле здесь. Играть с Lego — это просто привилегия ».

Впервые VPR получил национальную премию Мерроу за цифровой контент. Обе части были вдохновлены вопросами аудитории.

Из всех наград, присуждаемых журналистам, The Murrows являются одними из самых уважаемых в мире. Награды ставят общественный интерес превыше всего, и они признают истории, которые являются воплощением ценностей, принципов и стандартов, установленных Эдвардом Р.Марроу, пионер журналистики, установивший стандарт высочайшего качества тележурналистики.

Две национальные награды последовали за пятью региональными победами Эдварда Марроу VPR. VPR участвует в 10-м регионе RTDNA, который включает все шесть штатов Новой Англии. Здесь вы можете увидеть всех региональных победителей, а также национальных лауреатов премии Эдварда Р. Мерроу.

Премия PRNDI: последние новости: «Темный день для Вермонта»: разработчики NEK якобы обманули инвесторов из миллионов »

Питер Хиршфельд из

VPR был удостоен награды PRNDI за первое место за последние новости за его рассказ о предполагаемом Понци- вроде схемы, по которой владелец Джея Пика обманул иностранных инвесторов на миллионы.

PRNDI Awards — единственный национальный конкурс, посвященный награждению выдающихся новостей местного общественного радио. VPR соревновалась в категории Large Newsroom с ведущими общественными радиостанциями, включая WBUR в Бостоне, WNYC в Нью-Йорке и KQED в Сан-Франциско. Полный список победителей и ссылки на победившие работы можно найти здесь.

Мутанты интегразы класса II с изменениями предполагаемых сигналов ядерной локализации в основном блокируются на постнуклеарной стадии репликации вируса иммунодефицита человека типа 1

Интеграза причастна к ядерному импорту вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1). Анализы интегразы, однако, могут быть осложнены плейотропной природой мутаций: в то время как мутанты класса I дефектны по интеграции, мутанты класса II обнаруживают дополнительные дефекты сборки и / или обратной транскрипции. Ранее мы определили, что ВИЧ-1 (V165A), первоначально описанный как дефектный для ядерного импорта, был мутантом класса II. Здесь мы проанализировали мутанты, содержащие изменения в других предполагаемых сигналах ядерной локализации, включая (186) KRK (188) / (211) KELQKQITK (219) и Cys-130. Предыдущая работа установила, что ВИЧ-1 (K186Q), ВИЧ-1 (Q214L / Q216L) и ВИЧ-1 (C130G) дефектны по репликации, но фенотипическая классификация была неясной, и ядерный импорт в неделящиеся клетки не рассматривался.В соответствии с предыдущими сообщениями, большинство двудольных мутантов, изученных здесь, были дефектными по репликации. Эти мутанты, а также ВИЧ-1 (V165A) синтезировали пониженные уровни кДНК, но нормальную фракцию мутантной кДНК, локализованную в делящихся и неделящихся клеточных ядрах. Несколько неожиданно рекомбинантные мутантные белки класса II оказались каталитически активными, а слитые белки Vpr-интеграза класса II эффективно дополняли мутантный вирус класса I. Поскольку мутант Vpr-интегразы класса I эффективно дополнял мутантные вирусы класса II в условиях, когда Vpr-интегразы класса II не функционировали, мы заключаем, что классы I и II определяют две отдельные группы комплементации, и предполагаем, что мутанты класса II в первую очередь дефектны в постнуклеарный этап репликации ВИЧ-1.ВИЧ-1 (C130G) также был дефектен для обратной транскрипции, но Vpr-интеграза (C130G) не могла эффективно комплементировать мутантный ВИЧ-1 класса I. Поскольку ВИЧ-1 (C130A) рос как дикий тип, мы заключаем, что Cys-130 не важен для репликации, и предполагаем, что нарушение структуры интегразы способствовало плейотропному фенотипу ВИЧ-1 (C130G).

VPR-Bench: система оценки визуального распознавания мест с открытым исходным кодом с количественной оценкой точки обзора и изменения внешнего вида

Aanæs, H., Даль, А. Л., и Педерсен, К. С. (2012). Интересные точки интереса. Международный журнал компьютерного зрения , 97 (1), 18–35.

Артикул Google Scholar

Agarwal, S., Furukawa, Y., Snavely, N., Simon, I., Curless, B., Seitz, S.M, et al. (2011). Строим Рим за день. Связь с ACM , 54 (10), 105–112.

Артикул Google Scholar

Агравал, М., Конолиге, К., и Блас, М. Р. (2008). Censure: Центрирование экстремумов объемного звучания для обнаружения и сопоставления функций в реальном времени. В Европейская конференция по компьютерному зрению (стр. 102–115). Springer.

Андреассон, Х., и Дакетт, Т. (2004). Топологическая локализация для мобильных роботов с использованием всенаправленного зрения и локальных функций. Сборник материалов IFAC , 37 (8), 36–41.

Артикул Google Scholar

Анджели, А., Донсьё, С., Мейер, Дж. А., и Филлиат, Д. (2008). Инкрементальный топологический удар на основе видения. В IROS (стр. 1031–1036) IEEE.

Аранджелович, Р., и Зиссерман, А. (2014a). Дислокация: масштабируемая различимость дескриптора для распознавания местоположения. В Азиатская конференция по компьютерному зрению (стр. 188–204). Springer.

Аранджелович, Р., и Зиссерман, А. (2014b). Визуальный словарь с семантическим поворотом. В Азиатская конференция по компьютерному зрению (стр.178–195). Springer.

Аранджелович Р., Гронат П., Торий А., Пайдла Т. и Сивич Дж. (2016). NetVLAD: архитектура CNN для распознавания мест со слабым контролем. В CVPR (стр. 5297–5307).

Бабенко А., Слесарев А., Чигорин А., Лемпицкий В. (2014). Нейронные коды для поиска изображений. В Европейская конференция по компьютерному зрению (стр. 584–599). Springer

Бадино, Х., Хубер, Д., и Канаде, Т.(2012). Топометрическая локализация в реальном времени. В ICRA (стр. 1635–1642). IEEE.

Bay, H., Tuytelaars, T., & Van Gool, L. (2006). Серфинг: улучшенные надежные функции. В ECCV (стр. 404–417). Springer.

Cadena, C., Carlone, L., Carrillo, H., Latif, Y., Scaramuzza, D., Neira, J., et al. (2016). Прошлое, настоящее и будущее одновременной локализации и картирования: к эпохе надежного восприятия. IEEE T-RO , 32 (6), 1309–1332.

Артикул Google Scholar

Calonder, M., Lepetit, V., Ozuysal, M., Trzcinski, T., Strecha, C., & Fua, P. (2011). Краткое описание: очень быстрое вычисление локального двоичного дескриптора. IEEE T-PAMI , 34 (7), 1281–1298.

Артикул Google Scholar

Камара, Л. Г., Геберт, К., и Преусил, Л. (2019). Высокоустойчивое визуальное распознавание мест за счет пространственного сопоставления функций CNN.Препринт ResearchGate.

Камара, Л. Г., и Пржеучил, Л. (2019). Распознавание мест на основе пространственно-семантической свертки. В 2019 Европейская конференция по мобильным роботам (ECMR) (стр. 1–8). IEEE.

Цао, Б., Арауджо, А., и Сим, Дж. (2020). Объединение глубоких локальных и глобальных функций для поиска изображений. arXiv: 2001.05027

Чанкан, М., Эрнандес-Нуньес, Л., Нарендра, А., Бэррон, А. Б., и Милфорд, М. (2020). Гибридная компактная нейронная архитектура для визуального распознавания места. Письма по робототехнике и автоматизации IEEE , 5 (2), 993–1000.

Артикул Google Scholar

Chen, DM, Baatz, G., Köser, K., Tsai, SS, Vedantham, R., Pylvänäinen, T., Roimela, K., Chen, X., Bach, J., Pollefeys, M ., и другие. (2011). Распознавание городских достопримечательностей на мобильных устройствах. В CVPR 2011 (стр. 737–744).

Чен, З., Якобсон, А., Эрдем, У. М., Хассельмо, М.Э. и Милфорд М. (2014a). Распознавание мест в разных масштабах. В 2014 Международная конференция IEEE по робототехнике и автоматизации (ICRA) . IEEE

Чен З., Лам О., Якобсон А. и Милфорд М. (2014b). Распознавание мест на основе сверточной нейронной сети. препринт arXiv: 1411.1509.

Чен, З., Маффра, Ф., Са, И., и Чли, М. (2017a). Посмотрите только один раз, извлекая отличительные ориентиры из convnet для визуального распознавания места.В IROS (стр. 9–16). IEEE.

Чен, З., Лю, Л., Са, И., Ге, З., и Чли, М. (2018). Модель гибкого внимания в контексте обучения для долгосрочного визуального распознавания места. Письма по робототехнике и автоматизации IEEE , 3 (4), 4015–4022.

Артикул Google Scholar

Chen, Z., et al. (2017b). Масштабные функции глубокого обучения для визуального распознавания мест. В ICRA (стр.3223–3230). IEEE.

Шерон, К. Т. Э. (2018). Оценка функций для оценки позы и ее применение к видео с произвольной точкой обзора. Кандидатская диссертация, Тринити-колледж.

Cieslewski, T., & Scaramuzza, D. (2017). Эффективное децентрализованное визуальное распознавание мест по дескрипторам полного изображения. В 2017 Международный симпозиум по мульти-роботам и мультиагентным системам (MRS) (стр. 78–82). IEEE.

Cieslewski, T., Choudhary, S., & Скарамуцца, Д. (2018). Децентрализованный визуальный удар с эффективным использованием данных. В Международная конференция IEEE 2018 по робототехнике и автоматизации (ICRA) (стр. 2466–2473). IEEE.

Cummins, M., & Newman, P. (2011). Только внешний вид в большом масштабе с fab-map 2.0. IJRR , 30 (9), 1100–1123.

Google Scholar

Дэвисон А. Дж., Рид И. Д., Молтон Н. Д. и Стасс О.(2007). MonoSLAM: захлопывание одной камеры в реальном времени. Транзакции IEEE по анализу шаблонов и машинному анализу , 29 (6), 1052–1067.

Артикул Google Scholar

Демир, М., и Бозма, Х. И. (2018). Автоматическое определение места на основе когерентных сегментов. In 2018 12-я международная конференция IEEE по семантическим вычислениям (ICSC) (стр. 71–76). IEEE.

DeTone, D., Malisiewicz, T., & Рабинович, А. (2018). Superpoint: Самостоятельное обнаружение и описание точек интереса. В мастерских CVPR (стр. 224–236).

Dusmanu, M., et al. (2019). D2-net: обучаемая CNN для совместного описания и обнаружения локальных особенностей. В CVPR (стр. 8092–8101).

Феррарини, Б., Вахид, М., Вахид, С., Эхсан, С., Милфорд, М. Дж., И Макдональд-Майер, К. Д. (2020). Изучение границ производительности визуального распознавания мест с повышенной точностью. Письма по робототехнике и автоматизации IEEE , 5 (2), 1688–1695.

Артикул Google Scholar

Филлиат Д. (2007). Метод визуального набора слов для интерактивной качественной локализации и картографии. В ICRA (стр. 3921–3926). IEEE.

Фраундорфер, Ф., Энгельс, К., & Нистер, Д. (2007). Топологическое отображение, локализация и навигация с использованием коллекций изображений. В 2007 Международная конференция IEEE / RSJ по интеллектуальным роботам и системам (стр.3872–3877). IEEE.

Гарднер, М.А., Сункавалли, К., Юмер, Э., Шен, X., Гамбаретто, Э., Гагне, К., и др. (2017). Учимся прогнозировать освещенность в помещении по одному изображению. Транзакции ACM с графикой (TOG) , 36 (6), 1–14.

Артикул Google Scholar

Гарг, С., Фишер, Т., и Милфорд, М. (2021 г.). Где твое место, визуальное распознавание места? Препринт arXiv arXiv: 2103.06443.

Гарг, С., Зендерхауф, Н., и Милфорд, М. (2018a). Не оглядывайтесь назад: роботизированная категоризация мест для распознавания мест без учета точки зрения и условий. В Международная конференция IEEE по робототехнике и автоматизации (ICRA) .

Гарг, С., Зендерхауф, Н., и Милфорд, М. (2018b). Потерянный? Распознавание мест с инвариантным внешним видом для противоположных точек зрения с использованием визуальной семантики. В Труды по робототехнике: Наука и системы XIV .

Garg, S., Sünderhauf, N., Dayoub, F., Morrison, D., Cosgun, A., Carneiro, G., et al. (2020). Семантика для роботизированного картографирования, восприятия и взаимодействия: обзор. Found Trends Robot , 8 (1-2), 1-224. https://doi.org/10.1561/2300000059.

Артикул Google Scholar

Гирдхар Ю. и Дудек Г. (2010). Сводки по онлайн-навигации. В 2010 Международная конференция IEEE по робототехнике и автоматизации (стр. 5035–5040).IEEE.

Гловер А. (2014). День и ночь, налево и направо. https://doi.org/10.5281/zenodo.45

Гордо, А., Алмазан, Дж., Рево, Дж., и Ларлус, Д. (2016). Глубокий поиск изображений: изучение глобальных представлений для поиска изображений. В Европейская конференция по компьютерному зрению . (стр. 241–257). Springer.

Гордо А., Алмазан Дж., Рево Дж. И Ларлус Д. (2017). Сквозное обучение глубоким визуальным представлениям для поиска изображений. Международный журнал компьютерного зрения , 124 (2), 237–254.

MathSciNet Статья Google Scholar

Хауслер С., Якобсон А. и Милфорд М. (2019). Слияние нескольких процессов: визуальное распознавание мест с использованием нескольких методов обработки изображений. Письма по робототехнике и автоматизации IEEE , 4 (2), 1924–1931.

Артикул Google Scholar

Хо, К.Л. и Ньюман П. (2007). Обнаружение замыкания цикла с помощью последовательностей сцен. IJCV , 74 (3), 261–286.

Артикул Google Scholar

Холд-Джеффрой, Ю., Сункавалли, К., Хадап, С., Гамбаретто, Э., и Лалонд, Дж. Ф. (2017). Оценка глубокой наружной освещенности. В Труды конференции IEEE по компьютерному зрению и распознаванию образов (стр. 7312–7321).

Hou, Y., Чжан, Х., и Чжоу, С. (2018). Оценка предложений объектов и функций свертки для визуального распознавания мест на основе ориентиров. Журнал интеллектуальных и робототехнических систем , 92 (3–4), 505–520.

Артикул Google Scholar

Jegou, H., Douze, M., & Schmid, C. (2008). Вложение Хэмминга и слабая геометрическая согласованность для поиска крупномасштабных изображений. В Европейская конференция по компьютерному зрению (стр.304–317). Springer.

Jégou, H., Douze, M., Schmid, C., & Pérez, P. (2010). Агрегирование локальных дескрипторов в компактное представление изображения. В CVPR (стр. 3304–3311). Компьютерное общество IEEE.

Jenicek, T., & Chum, O. (2019). Не бойтесь темноты: поиск изображения при различных условиях освещения. В Труды международной конференции IEEE по компьютерному зрению (стр. 9696–9704).

Джин Ю., Мишкин, Д., Мищук, А., Матас, Дж., Фуа, П., Йи, К. М., и Труллс, Э. (2020). Сопоставление изображений по широким базовым линиям: от бумаги к практике. Препринт arXiv arXiv: 2003.01587.

Джонс, Э., и Янг, Г. З. (2011). От изображений к сценам: сжатие кластера изображений в единую модель сцены для распознавания места. В 2011 Международная конференция по компьютерному зрению (стр 874–881). IEEE.

Халик, А., Эхсан, С., Чен, З., Милфорд, М., И Макдональд-Майер, К. (2019). Целостный подход к визуальному распознаванию места с использованием легких CNN для значительных изменений точки зрения и внешнего вида. Транзакции IEEE по робототехнике .

Konolige, K., & Agrawal, M. (2008). FrameSLAM: от настройки пакета до визуального отображения в реальном времени. Транзакции IEEE по робототехнике , 24 (5), 1066–1077.

Артикул Google Scholar

Копытков, Д., & Индельман, В. (2018). Байесовское восстановление информации из cnn для вероятностного вывода. В международной конференции 2018 IEEE / RSJ по интеллектуальным роботам и системам (IROS) (стр. 7795–7802). IEEE.

Кошецка, Дж., Ли, Ф., и Янг, X. (2005). Глобальная локализация и относительное позиционирование на основе не зависящих от масштаба ключевых точек. Робототехника и автономные системы , 52 (1), 27–38.

Артикул Google Scholar

Коставелис, И., & Гастератос, А. (2015). Семантическое отображение для задач мобильной робототехники: обзор. РАН , 66 , 86–103.

Google Scholar

Крижевский А., Суцкевер И. и Хинтон Г. Э. (2012). Классификация Imagenet с глубокими сверточными нейронными сетями. В Достижения в области нейронных систем обработки информации (стр. 1097–1105).

Ларссон, М., Стенборг, Э., Хаммарстранд, Л., Поллефейс, М., Саттлер, Т., и Каль, Ф. (2019). Набор данных межсезонной корреспонденции для надежной семантической сегментации. В CVPR (стр. 9532–9542).

Латеган, Х., Бек, Дж., Китт, Б., и Стиллер, К. (2013). Как изучить функцию изображения с устойчивым освещением для распознавания мест. В симпозиуме интеллектуальных транспортных средств IEEE 2013 (IV) (стр. 285–291). IEEE.

Лоу, Д. Г. (2004). Отличительные особенности изображения от масштабно-инвариантных ключевых точек. IJCV, Springer , 60 (2), 91–110.

Артикул Google Scholar

Lowry, S., Sünderhauf, N., Newman, P., Leonard, J. J., Cox, D., Corke, P., et al. (2015). Визуальное распознавание места: опрос. Транзакции IEEE по робототехнике , 32 (1), 1–19.

Артикул Google Scholar

Maddern, W., Milford, M., & Wyeth, G.(2012). CAT-SLAM: вероятностная локализация и отображение с использованием непрерывной траектории на основе внешнего вида. IJRR , 31 (4), 429–451.

Google Scholar

Мэддерн, В., Паско, Г., Линегар, К., и Ньюман, П. (2017). 1 год, 1000 км: набор данных Oxford robotcar. Международный журнал исследований робототехники , 36 (1), 3–15.

Артикул Google Scholar

Масоне, К., И Капуто Б. (2021). Обзор по глубокому визуальному распознаванию места. Доступ IEEE , 9 , 19516–19547.

Артикул Google Scholar

Макманус, К., Апкрофт, Б., и Ньюманн, П. (2014). Сигнатуры сцены: локализованные и безточечные функции для локализации. В конференции Робототехника, наука и системы .

Мэй, К., Сибли, Г., Камминс, М., Ньюман, П., и Рид, И.(2009). Эффективная стереосистема с постоянным временем. В Труды Британской конференции по машинному зрению (Том 1). BMVA Press

Merrill, N., & Huang, G. (2018). Легкая неконтролируемая глубокая застежка-петля. Конференция по робототехнике и системам . Препринт arXiv arXiv: 1805.07703.

Милфорд, М. (2013). Распознавание мест на основе зрения: как низко вы можете спуститься? Международный журнал исследований робототехники , 32 (7), 766–789.

Артикул Google Scholar

Милфорд, М. Дж., И Уайет, Г. Ф. (2012). SeqSLAM: визуальная навигация по маршруту для солнечных летних дней и штормовых зимних ночей. В Международная конференция по робототехнике и автоматизации (стр. 1643–1649). IEEE.

Мишкин Д., Пердок М. и Мэйтас Дж. (2015). Распознавание мест с поиском WxBS. В семинаре PCVPR 2015 по визуальному распознаванию мест в изменяющейся среде (Vol.30).

Мохан А., Бейли Р., Уэйт Дж., Тамблин Дж., Гримм К. и Боденхаймер Б. (2007). Настольное компьютерное освещение для практической цифровой фотографии. Транзакции IEEE по визуализации и компьютерной графике , 13 (4), 652–662.

Артикул Google Scholar

Маунт Дж. И Милфорд М. (2016). 2d визуальное распознавание места для домашних служебных роботов в ночное время. В 2016 Международная конференция IEEE по робототехнике и автоматизации (ICRA) (стр.4822–4829). IEEE.

Мусавян А., Кошецка Дж. И Лиен Дж. М. (2015). Распознавание местоположения на открытом воздухе с семантическим управлением. В 2015 Международная конференция IEEE по робототехнике и автоматизации (ICRA) (стр. 4882–4889). IEEE.

Мурильо, А.С., и Косецка, Дж. (2009). Эксперименты по распознаванию мест с использованием истинных панорам. В мастерских ICCV (стр. 2196–2203). IEEE.

Мурильо, А. К., Герреро, Дж.Дж. И Сигес, К. (2007). Функции серфинга для эффективной локализации роботов с помощью всенаправленных изображений. В протоколе Proceedings of IEEE ICRA (стр. 3901–3907).

Мурманн, Л., Дэвис, А., Каутц, Дж., И Дюран, Ф. (2016). Вычислительная отраженная вспышка для портретов в помещении. Транзакции ACM с графикой (TOG) , 35 (6), 1–9.

Артикул Google Scholar

Мурманн, Л., Гарби, М., Айттала, М., & Дюран, Ф. (2019). Набор данных с множественным освещением внешнего вида внутреннего объекта. В Международная конференция IEEE по компьютерному зрению (ICCV) 2019 .

Нарди, Л., Боден, Б., Зия, М.З., Мавер, Дж., Нисбет, А., Келли, PH, Дэвисон, А.Дж., Лухан, М., О’Бойл, М.Ф., Райли, Дж. ., и другие. (2015). Представляем slambench — методологию тестирования производительности и точности для slam. В 2015 Международная конференция IEEE по робототехнике и автоматизации (ICRA) (стр.5783–5790). IEEE.

Насир, Т., Оливейра, Г.Л., Брокс, Т., и Бургард, В. (2017). Визуальная локализация с учетом семантики в сложных условиях восприятия. В 2017 IEEE ICRA (стр. 2614–2620).

Но, Х., Арауджо, А., Сим, Дж., Вейанд, Т., и Хан, Б. (2017). Поиск крупномасштабных изображений с внимательными глубокими локальными особенностями. В Труды международной конференции IEEE по компьютерному зрению (стр. 3456–3465).

Одо, А., Маккенна, С., Флинн, Д., и Форстиус, Дж. (2020). К автоматическому визуальному мониторингу опор электричества по аэрофотоснимкам. В 15-я Международная совместная конференция по теории и приложениям компьютерного зрения, визуализации и компьютерной графики 2020 (стр. 566–573). SciTePress.

Олива, А., и Торральба, А. (2006). Создание сути сцены: роль глобальных характеристик изображения в распознавании. Прогресс в исследованиях мозга , 155 , 23–36.

Артикул Google Scholar

Пол Р., Фельдман Д., Рус Д. и Ньюман П. (2014). Генерация визуальной точности с использованием наборов ядер. В 2014 Международная конференция IEEE по робототехнике и автоматизации (ICRA) (стр. 1304–1311). IEEE.

Пепперелл, Э., Корк, П. И., и Милфорд, М. Дж. (2014). Распознавание мест в любой среде с помощью smart. В 2014 Международная конференция IEEE по робототехнике и автоматизации (ICRA) (стр.1612–1618). IEEE.

Пепперелл, Э., Корк, П. И., и Милфорд, М. Дж. (2015). Автоматическое масштабирование изображения для распознавания мест в меняющихся условиях. В 2015 Международная конференция IEEE по робототехнике и автоматизации (ICRA) (стр. 1118–1124). IEEE.

Перроннин, Ф., Лю, Й., Санчес, Дж., И Пуарье, Х. (2010). Поиск крупномасштабных изображений со сжатыми векторами Фишера. В конференции 2010 года компьютерного общества IEEE по компьютерному зрению и распознаванию образов (стр.3384–3391). IEEE.

Филбин Дж., Чам О., Айсард М., Сивик Дж. И Зиссерман А. (2007). Поиск объектов с большим словарем и быстрым пространственным сопоставлением. В конференции IEEE по компьютерному зрению и распознаванию образов .

Филбин Дж., Чам О., Айсард М., Сивик Дж. И Зиссерман А. (2008). Потери при квантовании: улучшение поиска конкретного объекта в крупномасштабных базах данных изображений. В конференции IEEE по компьютерному зрению и распознаванию образов .

Порав, Х., Маддерн, В., и Ньюман, П. (2018). Состязательная подготовка в неблагоприятных условиях: надежная метрическая локализация с использованием переноса внешнего вида. В Международная конференция IEEE 2018 по робототехнике и автоматизации (ICRA) (стр. 1011–1018). IEEE.

Раденович, Ф., Исцен, А., Толиас, Г., Авритис, Ю., и Чум, О. (2018). Возвращаясь к Оксфорду и Парижу: сравнительный анализ крупномасштабного поиска изображений. В Труды конференции IEEE по компьютерному зрению и распознаванию образов (CVPR) .

Раденович, Ф., Толиас, Г., и Чум, О. (2018). Точная настройка поиска изображений CNN без человеческих комментариев. Транзакции IEEE по анализу шаблонов и машинному анализу , 41 (7), 1655–1668.

Артикул Google Scholar

Ранганатан А. (2013). Обнаружение и маркировка мест с помощью обнаружения точек изменения во время выполнения и классификаторов маркировки мест. Патент США 8,559,717.

Revaud, J., Алмазан, Дж., Резенде, Р. С., и Соуза, К. Р. Д. (2019a). Обучение со средней точностью: поиск обучающего изображения с потерей списка. В Труды международной конференции IEEE по компьютерному зрению (стр. 5107–5116).

Revaud, J., De Souza, C., Humenberger, M., & Weinzaepfel, P. (2019b). R2d2: надежный и повторяемый детектор и дескриптор. В Достижения в области нейронных систем обработки информации (стр. 12405–12415).

Робертсон Д.П., и Чиполла Р. (2004). Система на основе изображений для городской навигации. В BMVC (том 19, с. 165). Citeseer.

Рос, Г., Селларт, Л., Матерзинска, Дж., Васкес, Д., и Лопес, А. М. (2016). Набор данных synthia: большая коллекция синтетических изображений для семантической сегментации городских сцен. В Труды конференции IEEE по компьютерному зрению и распознаванию образов (стр. 3234–3243).

Rosten, E., & Drummond, T.(2006). Машинное обучение для высокоскоростного обнаружения углов. В ECCV (стр. 430–443). Springer.

Сахдев Р. и Цоцос Дж. К. (2016). Система распознавания внутренних помещений для локализации мобильных роботов. In 2016 13-я конференция по компьютерному зрению и роботизированному зрению (CRV) (стр. 53–60). IEEE.

Сарлин, П. Э., Кадена, К., Сигварт, Р., и Дымчик, М. (2019). От грубого к мелкому: надежная иерархическая локализация в большом масштабе. В CVPR (стр.12716–12725).

Саттлер, Т., Хавлена, М., Шиндлер, К., и Поллефейс, М. (2016). Распознавание крупномасштабного местоположения и проблема геометрической нестабильности. В Труды конференции IEEE по компьютерному зрению и распознаванию образов (стр. 1582–1590).

Саттлер, Т., Маддерн, В., Тофт, К., Торий, А., Хаммарстранд, Л., Стенборг, Э., Сафари, Д., Окутоми, М., Поллефейс, М., Сивик , J., et al. (2018). Тестирование 6dof наружной визуальной локализации в изменяющихся условиях.В Труды конференции IEEE по компьютерному зрению и распознаванию образов (стр. 8601–8610).

Schönberger, J. L., Pollefeys, M., Geiger, A., & Sattler, T. (2018). Семантическая визуальная локализация. В Труды конференции IEEE по компьютерному зрению и распознаванию образов (стр. 6896–6906).

Се, С., Лоу, Д., и Литтл, Дж. (2002). Локализация и отображение мобильных роботов с неопределенностью с использованием масштабно-инвариантных визуальных ориентиров. IJRR , 21 (8), 735–758.

Google Scholar

Серманет П., Эйген Д., Чжан Х., Матье М., Фергус Р. и ЛеКун Ю. (2014). Overfeat: интегрированное распознавание, локализация и обнаружение с использованием сверточных сетей. В 2-я Международная конференция по обучению представлений, ICLR 2014 .

Симеони, О., Авритис, Ю., и Чум, О. (2019). Локальные особенности и визуальные слова появляются в активациях.В Труды конференции IEEE по компьютерному зрению и распознаванию образов (стр. 11651–11660).

Сингх Г. и Косека Дж. (2010). Закрытие визуального цикла с использованием дескрипторов сущности в мире Манхэттена. В ICRA семинар всенаправленного зрения (стр. 4042–4047).

Сивич Дж. И Зиссерман А. (2003). Видео Google: метод поиска текста для сопоставления объектов в видео. В Нулевой (стр. 1470). IEEE.

Скиннер, Дж., Гарг, С., Зундерхауф, Н., Корке, П., Апкрофт, Б., и Милфорд, М. (2016). Моделирование с высокой точностью для оценки работы роботизированного зрения. В , 2016 Международная конференция IEEE / RSJ по интеллектуальным роботам и системам (IROS) (стр. 2737–2744). IEEE.

Скреде, С. (2013). Набор данных Nordland. https://bit.ly/2QVBOym.

Стенборг, Э., Тофт, К., и Хаммарстранд, Л. (2018). Долгосрочная визуальная локализация с использованием семантически сегментированных изображений.В 2018 IEEE ICRA (стр. 6484–6490).

Штумм, Э., Мей, К., и Лакруа, С. (2013). Вероятностное распознавание мест с помощью карт видимости. В IROS (стр. 4158–4163). IEEE.

Штурм, Дж., Энгельхард, Н., Эндрес, Ф., Бургард, В., и Кремерс, Д. (2012). Эталон для оценки систем захвата RGB-D. В 2012 Международная конференция IEEE / RSJ по интеллектуальным роботам и системам . (стр. 573–580). IEEE.

Sünderhauf, N., & Protzel, P. (2011). Кратко — замыкаем петлю простыми средствами. В IROS (стр. 1234–1241). IEEE.

Sünderhauf, N., Neubert, P., & Protzel, P. (2013). Мы уже на месте? бросая вызов SeqSLAM на 3000 км в любое время года. В Proc. семинара по долгосрочной автономии, Международной конференции IEEE по робототехнике и автоматизации (ICRA) (стр. 2013). Citeseer.

Sünderhauf, N., Shirazi, S., Dayoub, F., Upcroft, B., & Милфорд, М. (2015). О производительности функций convnet для распознавания места. В IROS (стр. 4297–4304). IEEE.

Талбот Б., Гарг С. и Милфорд М. (2018). OpenSeqSLAM2. 0: набор инструментов с открытым исходным кодом для визуального распознавания мест в меняющихся условиях. В международной конференции 2018 IEEE / RSJ по интеллектуальным роботам и системам (IROS) (стр. 7758–7765). IEEE.

Типальди, Г. Д., Спинелло, Л., и Бургард, В. (2013).Геометрические фразы флирта для крупномасштабного распознавания мест в данных 2-го диапазона. В 2013 Международная конференция IEEE по робототехнике и автоматизации (стр. 2693–2698). IEEE.

Толиас, Г., Авритис, Й., и Джегу, Х. (2013). Агрегировать или не агрегировать: ядра выборочного соответствия для поиска изображений. В Труды международной конференции IEEE по компьютерному зрению (стр. 1401–1408).

Толиас, Г., Авритис, Й., и Джегу, Х.(2016a). Поиск изображений с ядрами выборочного соответствия: агрегирование по одному и нескольким изображениям. Международный журнал компьютерного зрения , 116 (3), 247–261.

MathSciNet Статья Google Scholar

Толиас, Г., Сикре, Р., и Джегу, Х. (2016b). Извлечение конкретного объекта с интегральным максимальным объединением активаций CNN. В ICLR . arXiv: 1511.05879.

Томитэ, М.А., Заффар, М., Милфорд, М., Макдональд-Майер, К., и Эхсан, С. (2020). ConvSequential-SLAM: основанный на последовательности, не требующий обучения метод визуального распознавания места для меняющейся среды. Препринт arXiv arXiv: 2009.13454.

Tomită, M. A., Zaffar, M., Milford, M., McDonald-Maier, K., & Ehsan, S. (2021). Фильтрация на основе последовательности для визуальной навигации на основе маршрута: анализ преимуществ, компромиссов и вариантов дизайна. Препринт arXiv arXiv: 2103.01994.

Topp, E.А., и Кристенсен, Х. И. (2008). Выявление структурных неоднозначностей и переходов во время экскурсии. В 2008 Международная конференция IEEE по робототехнике и автоматизации (стр. 2564–2570). IEEE.

Torii, A., Arandjelovic, R., Sivic, J., Okutomi, M., Pajdla, T. (2015). 24/7 Распознавание мест путем синтеза взглядов. В Труды конференции IEEE по компьютерному зрению и распознаванию образов (стр. 1808–1817).

Torii, A., Sivic, J., Пайдла, Т., и Окутоми, М. (2013). Визуальное распознавание мест с повторяющимися структурами. В Труды конференции IEEE по компьютерному зрению и распознаванию образов (стр. 883–890).

Torii, A., Taira, H., Sivic, J., Pollefeys, M., Okutomi, M., Pajdla, T., & Sattler, T. (2019). Действительно ли для точной визуальной локализации необходимы масштабные 3d модели? Транзакции IEEE по анализу шаблонов и машинному анализу .

Уй, м.А., и Ли, Г. Х. (2018). Pointnetvlad: поиск на основе глубокого облака точек для крупномасштабного распознавания мест. В Труды конференции IEEE по компьютерному зрению и распознаванию образов (стр. 4470–4479).

Ван Дж., Чжа Х. и Чиполла Р. (2005). Объединение точек интереса и краев для поиска изображений на основе содержимого. В Международная конференция IEEE по обработке изображений 2005 (Том 3, стр. III – 1256). IEEE.

Варбург, Ф., Хауберг, С., Лопес-Антекера, М., Гаргалло, П., Куанг, Ю., и Сивера, Дж. (2020). Мапиллярные последовательности улиц: набор данных для распознавания мест на протяжении всей жизни. В Труды конференции IEEE / CVF по компьютерному зрению и распознаванию образов (стр. 2626–2635).

Weyand, T., Araujo, A., Cao, B., & Sim, J. (2020). Набор данных Google Landmarks v2 — крупномасштабный тест для распознавания и извлечения на уровне экземпляра. В Труды конференции IEEE / CVF по компьютерному зрению и распознаванию образов (стр.2575–2584).

Е. Ю., Чеслевски Т., Локерчио А. и Скарамуцца Д. (2017). Распознавание мест на полуплотных картах: геометрические подходы и подходы на основе обучения. В Британская конференция по машинному зрению (BMVC) .

Йи, К. М., Труллс, Э., Лепетит, В., и Фуа, П. (2016). Подъем: Выученное преобразование инвариантного признака. В Европейская конференция по компьютерному зрению . (стр. 467–483). Springer.

Заффар, М., Эхсан, С., Милфорд, М., Майер, К. М. (2018). Памятные карты: структура для переопределения мест в визуальном распознавании мест. Препринт arXiv arXiv: 1811.03529.

Заффар, М., Эхсан, С., Милфорд, М., и Макдональд-Майер, К. (2020). Cohog: легкий, эффективный с точки зрения вычислений и не требующий обучения метод визуального распознавания места для меняющейся среды. Письма по робототехнике и автоматизации IEEE , 5 (2), 1835–1842.

Артикул Google Scholar

Заффар, М., Халик, А., Эхсан, С., Милфорд, М., Алексис, К., и Макдональд-Майер, К. (2019a). Подойдут ли современные методы визуального распознавания места для воздушной робототехники? В Мастерская ICRA 2019 по воздушной робототехнике . Препринт arXiv arXiv: 1904.07967.

Заффар, М., Халик, А., Эхсан, С., Милфорд, М., и Макдональд-Майер, К. (2019b). Выравнивание игрового поля: всестороннее сравнение подходов к визуальному распознаванию мест в меняющихся условиях. В семинар IEEE ICRA по созданию баз данных и сравнительному анализу .Препринт arXiv arXiv: 1903.09107.

Цзэн, Ф., Якобсон, А., Смит, Д., Босуэлл, Н., Пейнот, Т., и Милфорд, М. (2019). Поиск: точное определение местоположения под землей в реальном времени для автономных горнодобывающих машин. В 2019 Международная конференция по робототехнике и автоматизации (ICRA) (стр. 1444–1450). IEEE.

Чжан, X., Ван, Л., и Су, Ю. (2021). Визуальное распознавание места: опрос с точки зрения глубокого обучения. Распознавание образов , 113 , 107760.

Артикул Google Scholar

ВИЧ-1 Vpr ингибирует созревание и активацию макрофагов и дендритных клеток in vitro | Международная иммунология

Аннотация

Vpr вируса иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1) кодирует белок 14 кДа, который участвует в вирусном патогенезе посредством in vitro и модуляции нескольких функций клетки-хозяина. Vpr модулирует клеточную пролиферацию, дифференцировку клеток, апоптоз и транскрипцию клетки-хозяина таким образом, что включает глюкокортикоидный путь.Чтобы лучше понять роль Vpr ВИЧ-1 в экспрессии генов хозяина, оценивали модуляцию ∼9600 клеточных РНК-транскриптов в первичных APC после обработки биоактивным рекомбинантным Vpr (rVpr) с помощью ДНК-микромассивов. Будучи внеклеточным доставляемым белком, Vpr подавлял экспрессию нескольких иммунологически важных молекул, включая костимулирующие молекулы CD40, CD80, CD83 и CD86, на MDM (макрофагах, полученных из моноцитов) и MDDC (дендритных клетках, полученных из моноцитов). Известно, что созревание дендритных клеток (ДК) приводит к снижению способности продуцировать ВИЧ из-за пост-входного блока репликативного цикла ВИЧ-1.Основываясь на изменениях, наблюдаемых в массиве генов, мы проанализировали созревание DC, генерируемых из моноцитов в культуре ткани, под влиянием Vpr. Мы наблюдали, что обработанные Vpr незрелые MDM и MDDC были неспособны приобретать высокие уровни костимулирующих молекул и не могли развиваться в зрелые DC даже в присутствии сигналов созревания. Эти исследования имеют важное значение для понимания взаимодействия ВИЧ с иммунной системой хозяина.

Антигенпрезентирующие клетки APC, дендритные клетки DC, вирус иммунодефицита человека ВИЧ, незрелые DC iDC, зрелые DC mDC, макрофаги, полученные из моноцитов MDDC, дендритные клетки, полученные из моноцитов MDDC, зеленый митотрекер MTG, мононуклеарные клетки периферической крови PBMC, рекомбинантный вирусный белок rVpr R, вирусный белок Vpr R, гликопротеин вируса везикулярного стоматита VSV-G

Введение

Антигенпрезентирующие клетки [макрофаги / дендритные клетки (DC)], помимо того, что они являются основной мишенью / резервуаром вирусной инфекции, играют важную роль в активации иммунной системы.DC являются критическими антигенпрезентирующими клетками (APC) для индукции первичных иммунных ответов благодаря: (i) их высокой эффективности в захвате антигена; (ii) их способность обрабатывать антиген; (iii) их миграционная способность; и (iv) их обильная экспрессия молекул, необходимых для активации и экспрессии Т-клеток (1). Кроме того, известно, что макрофаги и дендритные клетки экспрессируют рецептор CD4 и восприимчивы к инфицированию ВИЧ-1. Эти клетки также экспрессируют основные корецепторы ВИЧ CCR5 и CXCR4 и, как полагают, действуют как резервуары для распространения вируса (2).Кроме того, функция APC имеет решающее значение для инициирования и поддержания ответа Т-клеток. Соответственно, понимание влияния продуктов генов ВИЧ на биологию дендритных клеток, вероятно, предоставит важную информацию об иммунном патогенезе ВИЧ-инфекции. Считается, что генерация антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов имеет важное значение для борьбы с ВИЧ-инфекцией (3,4). Фактически, существует обратная корреляция между вирусной нагрузкой и активностью ЦТЛ, что позволяет предположить, что активация Т-клеток имеет решающее значение для ограничения распространения вируса (5).Следовательно, понимание того, как представление антигена модулируется генами ВИЧ-1, важно для понимания вирусного патогенеза.

В этом исследовании мы сосредоточились на модуляции функции APC с помощью вспомогательного белка ВИЧ-1 Vpr. Этот вирусный антиген ВИЧ модулирует многочисленные клеточные события, включая остановку клеточного цикла, дифференцировку, апоптоз, подавление NF-κB, ядерную грыжу и миграцию ядер (6-15). Ранее мы и другие сообщали, что Vpr подавляет путь NF-κB путем связывания и передачи сигналов через рецепторный комплекс глюкокортикоидов (13,16).Считается, что этот путь ослабляет распознавание врожденного иммунитета моноцитами и подавляет продукцию β-хемокинов макрофагами (17,18). Однако прямое влияние Vpr на макрофаги / DC для регуляции активации Т-клеток не исследовалось. Это важно, поскольку ВИЧ нацелен на APC для распространения в лимфатические узлы для Т-клеточной инфекции и из-за способности клеток передавать Vpr (19, 20). Поэтому мы реализовали комплексный анализ микромассивов рекомбинантных Vpr (rVpr) -обработанных PBMC (мононуклеарных клеток периферической крови), чтобы наблюдать влияние Vpr на профили транскрипции.Интересно, что мы установили, что основные костимулирующие молекулы, включая CD40, CD80 и CD86, сильно уменьшены в клетках, обработанных rVpr. Кроме того, введения rVpr на уровне пикограмм было достаточно, чтобы препятствовать созреванию DC и подавлять поверхностную экспрессию молекул MHC Class II. Наши данные предполагают, что это ингибирование созревания ингибирование APC напрямую препятствует презентации и пролиферации Т-клеток. Кроме того, обработки Vpr АРС, обработанного Vpr, было достаточно, чтобы вызвать фенотип слабого ответа, вероятно, из-за плохой презентации антигена без костимуляции.

Методы

Реактивы и антитела

Рекомбинантный человеческий (rh) IL-4, rhTNF-α, rhGM-CSF и mAb против CD3 и конъюгированные mAb человека к CD1a, CD3, CD4, CD8, CD14, CD33, CD80, CD83, CD86, HLA класса I, DC-sign и MHC-IIDR и соответствующие им изотипы были приобретены у BD Biosciences Pharmingen (Сан-Диего, Калифорния). PHA был приобретен у Sigma Chemical Co. (Сент-Луис, Миссури).

Получение Т-лимфоцитов из мононуклеарных клеток периферической крови

PBMC получали с использованием центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Hypaque ™ Plus (Amersham Pharmacia LKB, Piscataway, NJ), приобретенного в Human Immunology Core / CFAR Immunology Core, Школа медицины Университета Пенсильвании.Затем клетки выращивали в RPMI с 10% FBS, стимулированной PHA, в течение 2 дней, и клетки выращивали на среде, содержащей rIL-2. Т-клетки выделяли из PBMC с использованием системы разделения MACS (Miltenyi Biotech, Auburn, CA) с использованием набора для выделения Т-клеток CD4 ⁺. За начальным этапом отрицательного отбора Т-клеток CD4 ⁺ последовал второй этап отрицательного отбора клеток CD45RA ⁺. CD45RA ⁺ CD4 ⁺ Т-клетки имели чистоту> 95% по оценке с помощью анализа FACS.Т-клетки стимулировали связанными с планшетом анти-CD3-антителами (1 мкг / мл) и IL-2 (10 Ед / мл) в течение 24 часов в 24-луночных планшетах.

Создание и культура MDM и MDDC

MDM и MDDC были получены из PBMC, как описано Romani et al. (21). Вкратце, PBMC человека выделяли последовательным центрифугированием на градиентах фиколла-гипака и перколла (Amersham Pharmacia LKB, Piscataway, NJ). Для выделения моноцитов клетки CD14 ⁺ очищали от PBMC положительным обогащением с использованием autoMACS (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) в соответствии с инструкциями производителя.Прилипшие моноциты культивировали в полной среде RPMI 1640 с 500 ед. / Мл rhIL-4 и 1000 ед. / Мл rhGM-CSF на 10 ⁶ клеток. Чистота выделенных популяций клеток моноцитов составила> 98%, как определено с помощью окрашивания FACS на CD14 ⁺. Для каждого препарата DC моноциты выделяли, как описано выше, и культивировали в культуральной среде, включающей 1000 ед. / Мл rhGM-CSF и 500 ед. / Мл rhIL-4. На 5 день неприлипающие клетки смывали, один раз промывали PBS и переносили в 6-луночные планшеты при 7 × 10 ⁵ клеток в 3 мл / лунку.Полученный в результате препарат клеток содержал> 90% DC по оценке морфологии и анализа FACS.

Для дифференцировки в зрелые DC (mDC) незрелые DC (iDC) дополнительно стимулировали на 6 день с помощью 10 нг / мл rTNF-α. Незрелые DC обычно были HLA-DR ⁺⁺, CD86 ⁺⁺, CD83 ^{— / weak} и CD14 ^weak, тогда как зрелые DC были HLA-DR ⁺⁺⁺, CD86 ⁺⁺⁺⁺ , CD83 ⁺⁺⁺ и CD14 ^—. Все цитокины, использованные в этом исследовании, были рекомбинантными белками человека и использовались при плато концентрации для индукции оптимального образования DC.

Конструирование и генерация молекул Vpr ВИЧ-1

Клон ВИЧ-1 pNL4-3 HSA.R ^— E ^— или pNL4-3 HSA.R ⁺ E ^— был получен из NIH AIDS Research and Reference Reagent Program (NIH-AIDS-RRRP ). Эти вирусы были признаны дефицитными по env и vpr путем введения сдвига рамки считывания и, следовательно, могли генерировать только некомпетентные к репликации вирионы (7). Вирионы ВИЧ-1, содержащие Vpr, устанавливаются путем котрансфекции 10 мкг pNL4-3.HSA.R ⁺ E ^— с 5 мкг pEnv (оболочка VSV-G: гликопротеиновая оболочка вируса везикулярного стоматита) или 10 мкг pNL43.HSA.R ^— E ^— с 5 мкг pEnv ( VSV-G envelope) и 5 мкг конструкций pVpr в клетках 293T (American Type Culture Collection, Rockville, MD). Для приготовления инфекционных вирусных исходов клетки 293Т помещали на чашки для тканевых культур диаметром 100 мм и трансфекцию проводили с использованием DOTAP (Roche Applied Science, Индианаполис, Индиана). Через 6 часов после трансфекции среду заменяли свежей DMEM с добавлением 10% FBS.Через 72 часа после трансфекции супернатанты, содержащие вирус, собирали и затем центрифугировали в течение 10 минут при 1500 g для удаления клеток, пропускали через фильтры с размером пор 0,4 мкм и ультрацентрифугировали при 69000 g в течение 90 минут. Супернатанты собирали и ресуспендировали в 0,1 × сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS), и титры вирусов определяли с помощью набора для анализа ELISA p24 (Beckman Coulter, Майами, Флорида), а также окрашивания p24 ^gag с помощью анализа FACS. Штаммы вирусов хранили в аликвотах в присутствии 10% FCS при -80 ° C.Заражение проводили путем инкубации клеток-мишеней с соответствующим вирусом в концентрации 100 TCID ₅₀/10 ⁶ клеток / мл (12).

Очистка рекомбинантного белка Vpr

HIV-1 Ген vpr амплифицировали с помощью ПЦР с использованием следующих праймеров Vpr: Vpr (+) 5′-ACGGATCCATGGAACAAGCCCCAGA-3 ‘; Vpr (-) 5’-TGGATCTACTGGCTCCATT-3 ‘; и клонировали в вектор pTYB4 (New England Biolabs, Беверли, Массачусетс). Высокоочищенный (> 95%) рекомбинантный белок Vpr (pTYB4-Vpr) получали с использованием системы IMPACT-CN (New England Biolabs, Беверли, Массачусетс) для обработки клеток.Элюированный белок анализировали с помощью геля SDS – PAGE для оценки его чистоты. Было обнаружено, что rVpr имеет чистоту 99%. Белок Gag (p55) ВИЧ-1, полученный в рамках программы NIH AIDS Research and Reference Reagent Program (NIH-AIDS-RRRP), использовали в качестве контроля в нашем анализе. Этот метод очистки ранее описывался несколькими группами как воспроизводящий нативную активность Vpr (22). Для установления профиля доз использовали белок Vpr в концентрациях 0, 10, 100 и 1000 пг / мл. Нормальные человеческие РВМС от здоровых доноров-людей очищали центрифугированием в градиенте плотности Ficoll-Paque ™, как описано ранее.Клетки (1 × 10 ⁶) обрабатывали различными концентрациями белка rVpr или контрольного белка (rGag) в течение 6 часов, промывали PBS и ресуспендировали в среде RPMI с 10% FBS. Чтобы подтвердить специфичность нашего антитела, к клеткам добавляли антисыворотку против Vpr в различных разведениях (от 1:10 до 1:10 000), а затем анализировали. Отрицательные контроли обрабатывали имитатором (PBS).

Анализ микромассивов кДНК и анализ данных

Дифференциальная экспрессия генов клеток-хозяев, индуцированная

Vpr, осуществлялась с помощью микромассивов кДНК, как описано (23).Полную клеточную РНК экстрагировали с использованием набора для выделения РНК-агентов RNAgents (Promega, WI). После осаждения изопропанолом РНК промывали 70% этанолом; сушили на воздухе и ресуспендировали в воде, обработанной диэтилпирокарбонатом (DEPC), и хранили при -20 ° C. Концентрацию общей РНК измеряли абсорбционной спектрофотометрией при 260 нм, и соотношение A ₂₆₀ / A ₂₈₀ составляло в среднем 1,7–1,8. Мембраны микромассивов кДНК человека GDA (1.3) были приобретены в компании Genome systems (Incyte Genomics Inc).Этот массив состоял из 9600 отдельных пятен, каждое из которых представляло известный ген человека. Поли (A) ⁺ РНК очищали из различных экспериментальных клеток, и 1 мкг мРНК использовали в качестве матрицы для получения кДНК, а амплифицированную мРНК (аРНК) из обработанных rVpr и ложных клеток получали в соответствии с описанным методом. Качармина и др. . (23). Для создания профилей экспрессии генов популяций мРНК, радиоактивно меченную аРНК использовали для проверки обратных нозерн-блотов, содержащих несколько тысяч кДНК-кандидатов.Затем радиоактивно меченные блоты сушили и помещали в кассету PhosphorImager (Molecular Dynamics) на 24 часа. Количественное определение интенсивности гибридизации проводили методом сканирующей денситометрии. Для сравнения относительных уровней экспрессии генов между экспериментальными и контрольными образцами рассчитывали отношения интенсивностей имитации к rVpr (или наоборот). Эти результаты были нормализованы с использованием глобального медианного значения экспрессии гена, вычисленного для каждого массива. Для повышения надежности данных пятна слабого сигнала были удалены в соответствии со следующими критериями.Отношения потенциально дифференциально регулируемых генов были рассчитаны после поправки на вариацию зонда с использованием конститутивно экспрессируемых генов на эквивалентных массивах (24). Любые гены, которые, по расчетам, имеют дифференциальную экспрессию менее чем в 2 раза, не учитывались. Это очень строгое значение отсечения было установлено для исключения ложноположительных результатов, но следует отметить, что это могло исключить некоторые гены, которые дифференциально экспрессировались в низких, но биологически значимых количествах.

Нозерн-блоттинг-анализ

Для анализа методом Нозерн-блоттинга 10 мкг общей РНК подвергали электрофорезу в 1.2% агарозно-формальдегидные гели, которые наносили на нейлоновую мембрану. Фильтры гибридизовали с использованием [α- ³² P] dCTP-меченой кДНК CD33 в качестве зонда с помощью набора для произвольно праймированной меченной ДНК (Promega, Madison, WI). Вкратце, фильтры были гибридизированы с мечеными зондами (1 × 10 ⁶ имп / мин / мл) в буфере (40% формамид, 4 × SSC, 10% декстрансульфат, 1 × раствор Денхардта, 40 мкг / мл обработанный ультразвуком и денатурированный лосось. ДНК сперматозоидов, 0,1% SDS, 20 мМ Трис, pH 7,5) при 42 ° C в течение 16 часов. Фильтры промывали дважды в течение 15 мин при комнатной температуре и один раз в течение 30 мин при 56 ° C с 2 × SSC, содержащим 0.1% SDS, а затем экспонировали с помощью пластины Kodak Imaging (25).

Анализ проточной цитометрии

Для окрашивания FACS суспензии отдельных клеток промывали PBS (pH 7,2), содержащим 0,2% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% NaN ₃. Клетки инкубировали с козьим IgG для блокирования связывания Ig с FcβR и окрашивали FITC или PE-меченными специфическими mAb, разведенными до оптимальной концентрации для иммуноокрашивания, в течение 30 мин при 4 ° C, трижды промывали и анализировали проточной цитометрией.Мертвые клетки исключались из анализа окрашиванием йодидом пропидия, а живые клетки определялись на основе их характеристик прямого и бокового рассеяния и анализировались непосредственно на проточном цитометре Coulter EPICS (Coulter, Hialeah, FL) с использованием программного обеспечения FlowJo (TreeStar, San Карлос, Калифорния). Все образцы сравнивали с соответствующими по изотипу контролями. В случае двойной проточной цитометрии отдельные образцы, обработанные только каждым изотипом, использовали для определения фоновых уровней аутофлуоресценции.

Анализ фагоцитоза

Т-клеток и MDM выделяли из PBMC здорового донора, как описано выше. Мы проанализировали методику проточной цитометрии in vitro для количественной оценки фагоцитарной способности макрофагов, как описано ранее, но с модификациями (26). Перед анализом фагоцитоза очищенные Т-клетки (количество клеток доведено до 2 × 10 ⁶ клеток / мл) трижды промывали RPMI-1640 и индуцировали апоптоз добавлением 500 нМ дексаметазона (Dex) в течение 6 ч инкубации при 37 °. С.Клетки центрифугировали при 500, g, в течение 5 мин и ресуспендировали в 10 мл культуральной среды. Апоптотические Т-клетки окрашивали 50 мкл MTG (25 мкг / мл) (Molecular Probes, OR) в течение 15 мин, а затем дважды промывали буфером Хенкса. Положительно окрашенные клетки ресуспендировали в культуральной среде и добавляли к очищенному MDM, который культивировали в 6-луночных планшетах в среде RPMI-1640, обработанной PBS (имитация), rGag (10 пг / мл) или rVpr (10 пг / мл). за 2 ч. Меченые Т-клетки ресуспендировали в RPMI-1640 и добавляли в планшеты с MDM в соотношении 10: 1 Т-клеток к MDM и инкубировали в течение 12 часов.Планшеты промывали RPMI-1640 для удаления несвязавшихся Т-клеток. MDM в планшетах промывали PBS, ресуспендировали в 200 мкл PBS и анализировали на экспрессию Mitotracker – FITC непосредственно на проточном цитометре Coulter EPICS (Coulter, Hialeah, FL) с использованием программного обеспечения FlowJo (TreeStar).

Иммуностимулирующая способность ДЦ

Моноциты были выделены из PBMC, и впоследствии эти моноциты были использованы для генерации DC. Зрелые DC предварительно обрабатывали rGag или rVpr (10 пг / мл) в течение 4 часов.Смеси клеток, обработанных rVpr и rGag, были следующими: только DC, обработанные rGag; 7/8 обработанных rGag DC и 1/8 rVpr-обработанных DC; 3/4 обработанных rGag DC и 1/4 rVpr обработанных DC; или только DC, обработанные rVpr. Градуированные количества каждой смеси и 10 ⁵ очищенных аллогенных Т-клеток (как обозначено) инкубировали в 96-луночных планшетах с плоским дном. Для проверки иммунокомпетентности Т-клеток две партии из 10 ⁶ зрелых DC обрабатывали либо rGag, либо rVpr (10 мкг) в течение 4 часов, а затем каждую инкубировали с 10 ⁷ алло-лимфоцитами в течение 2 дней.Затем DC удаляли с помощью планшетов, покрытых антителами к CD83 и CD86. Оставшиеся лимфоциты были затем подтверждены для популяции лимфоцитов с помощью анализа FACS и разделены на четыре партии. Две из этих партий предварительно инкубировали с DC, обработанными rVpr, а две другие предварительно инкубировали с DC, обработанными rGag. Эти четыре партии лимфоцитов затем снова заражали градуированными дозами DC из двух других партий из 10 ⁶ mDC от того же донора, которые предварительно обрабатывали либо rGag, либо rVpr в течение 4 часов.Через 6 дней клетки обрабатывали 1 мкКи [³ H] тимидина (NEN Life Science, Бостон, Массачусетс). Клетки собирали на фильтры и через 24 часа измеряли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике. Каждое условие культивирования тестировали в трех экземплярах и рассчитывали среднее количество импульсов в минуту (c.p.m.). Для фонового контроля в каждом эксперименте измеряли включение [³ H] тимидина Т-клеток или DC с одной средой (27). Все эксперименты проводились не менее трех раз, и показаны данные одного репрезентативного эксперимента.

Количественное определение секретируемых цитокинов с помощью ELISA

Мы измерили уровень цитокинов, присутствующих в супернатанте, с помощью ELISA с захватом. Мы измерили цитокины IL-12 и TNF-α в супернатанте культуры. Рекомбинантные белки использовали в качестве стандарта, а антитела для захвата и обнаружения были приобретены в R&D Systems (Миннеаполис, Миннесота). Анализ проводили согласно протоколу производителя. Вкратце, 96-луночные планшеты для ELISA покрывали захватывающими антителами (10 мкг / мл) в течение ночи при 4 ° C.Планшеты промывали 1 × PBS и блокировали 2% BSA в течение 1 ч при 37 ° C для уменьшения неспецифического связывания. Супернатанты от инфицированных клеточных культур добавляли в лунки в трех экземплярах при различных разведениях и инкубировали при 37 ° C в течение 1 часа с последующей промывкой и инкубацией с детектирующими антителами в течение 1 часа. Связанные антитела были разработаны путем добавления субстрата пероксидазы TMB и обнаружены при 450 нм в планшет-ридере для ELISA.

Результаты

Очистка и функциональный анализ Vpr

ВИЧ-1 Впр (89.6) был клонирован в вектор экспрессии pTYB4 с использованием фрагментов ДНК, амплифицированных с помощью ПЦР из провирусной матрицы. Очищенный фрагмент вставляли между сайтами Nco I и Sma I в векторе pTYB4. Конечные конструкции секвенировали и подтверждали их подлинность Vpr. rVpr экспрессировали с использованием бактериальной системы экспрессии слияния. Продукт расщепления дополнительно очищали очисткой на металлической аффинной колонке с последующим диализом при 4 ° C для обеспечения полного удаления любых солей и загрязнений.Очищенный белок Vpr, полученный из бактериальных клеток, показал единственную полосу с молекулярной массой 14 кДа, обнаруженную с помощью геля SDS-PAGE после вестерн-блоттинга с антителом против Vpr (фиг. 1A). Поскольку мы и другие сообщали, что Vpr вызывает остановку клеточного цикла и апоптоз, мы подтвердили функциональные эффекты этого рекомбинантного белка Vpr на индукцию остановки клеточного цикла и апоптоза. In vitro внеклеточные rVpr или rGag (контрольный белок) использовали для исследования активности Vpr на Т-клетках Jurkat.Эти эксперименты демонстрируют, что добавление этого внеклеточного белка rVpr сильно индуцировало остановку клеточного цикла в фазе G ₂ / M и апоптоз при концентрации только 10 пг / мл (фиг. 1B). Напротив, rGag мало влиял на остановку клеточного цикла и вызывал только фоновые уровни апоптоза по сравнению с rVpr. Эта активность согласуется с предыдущими отчетами об активности Vpr (22,28,29).

Рис. 1.

Очистка и биоактивность рВпр.Vpr продуцировали в виде слитого белка в бактериях с использованием системы интеина, как описано в методах. (А) Вестерн-блоттинг очищенного белка rVpr. Слитый белок и индуцированный продукт расщепления Vpr идентифицировали вестерн-блоттингом с использованием поликлональных антител против Vpr, полученных у кроликов. Дорожка 1 — фиктивная; полоса 2 представляет собой слитый белок без расщепления; и дорожка 3 представляет собой отщепленный очищенный белок rVpr. Слияние интеин-Vpr составляет 55 кДа, а свободный Vpr представляет собой белок 14 кДа. Стандарты указаны слева.(B) Влияние rVpr на остановку клеточного цикла и апоптоз. Клетки Jurkat (1 × 10 ⁶) обрабатывали следующим: mock, rGag (10 пг / мл) или rVpr (1 пг или 10 пг / мл). Через 24 часа после обработки клетки осаждали, окрашивали йодидом пропидия для остановки клеточного цикла и анализировали на апоптоз путем окрашивания аннексином V, как описано в Методиках. Содержание ДНК анализировали на основе необработанных контролей. Относительное количество клеток указано на оси y , а содержание ДНК указано на оси x .Аналогичным образом апоптоз был обнаружен с помощью проточной цитометрии, и числа, показанные на гистограмме, представляют процент клеток с экспонированным фосфатидилсерином, что указывает на положительный апоптоз. Эти результаты представляют три независимых эксперимента.

Рис. 1.

Очистка и биоактивность рВпр. Vpr продуцировали в виде слитого белка в бактериях с использованием системы интеина, как описано в методах. (А) Вестерн-блоттинг очищенного белка rVpr.Слитый белок и индуцированный продукт расщепления Vpr идентифицировали вестерн-блоттингом с использованием поликлональных антител против Vpr, полученных у кроликов. Дорожка 1 — фиктивная; полоса 2 представляет собой слитый белок без расщепления; и дорожка 3 представляет собой отщепленный очищенный белок rVpr. Слияние интеин-Vpr составляет 55 кДа, а свободный Vpr представляет собой белок 14 кДа. Стандарты указаны слева. (B) Влияние rVpr на остановку клеточного цикла и апоптоз. Клетки Jurkat (1 × 10 ⁶) обрабатывали следующим: mock, rGag (10 пг / мл) или rVpr (1 пг или 10 пг / мл).Через 24 часа после обработки клетки осаждали, окрашивали йодидом пропидия для остановки клеточного цикла и анализировали на апоптоз путем окрашивания аннексином V, как описано в Методиках. Содержание ДНК анализировали на основе необработанных контролей. Относительное количество клеток указано на оси y , а содержание ДНК указано на оси x . Аналогичным образом апоптоз был обнаружен с помощью проточной цитометрии, и числа, показанные на гистограмме, представляют процент клеток с экспонированным фосфатидилсерином, что указывает на положительный апоптоз.Эти результаты представляют три независимых эксперимента.

Дифференциальная экспрессия генов клеток-хозяев с помощью микромассивов кДНК

Экспрессию генов клетки-хозяина в обработанных белком rVpr (10 мкг) PBMC человека исследовали с помощью анализа микромассивов кДНК. Через два дня после обработки суммарную РНК выделяли из групп, обработанных rVpr, обработанных контрольным белком или обработанных имитатором, и мРНК получали из каждой группы. Выполняли парную гибридизацию, в которой образец экспрессии, полученный для каждой группы, сравнивали с каждой группой, подвергнутой ложной обработке.Для анализа была выбрана 2-дневная временная точка, так как это период после лечения, который, по-видимому, отражает высоту эффектов Vpr (19,22,28–30). Каждый фильтр содержит 9600 фрагментов кДНК, представляющих ранее охарактеризованные гены человека, разделенные на шесть квадрантов, представляющих различные категории генов, включая следующие: (i) онкогены, ген-супрессор опухоли и регуляторы клеточного цикла; (ii) гены стрессовой реакции, ионные каналы и транспортные гены; (iii) гены, связанные с апоптозом, и гены, участвующие в синтезе, репарации и рекомбинации ДНК; (iv) факторы транскрипции и общие ДНК-связывающие белки; (v) клеточные рецепторы, антиген клеточной поверхности и молекулы клеточной адгезии; и (vi) факторы межклеточной коммуникации.Необработанные данные были собраны, нормализованы и статистически проанализированы с использованием специального программного обеспечения, как указано в методах. Мы определили пороговое значение для генов, регулируемых rVpr, как значительно индуцируемых / подавляемых, когда экспрессия по крайней мере в 2 раза выше / ниже экспрессии, чем в контрольных экспериментальных образцах (рис. 2). Этот анализ служит для того, чтобы подчеркнуть конкретные важные изменения в экспрессии генов и облегчает анализ большого количества данных, полученных в ходе этого типа исследования.

Рис. 2.

(A) Блок-схема стратегии амплификации аРНК. Подробности в Методах. (B) Иерархическая кластеризация экспрессии гена в первичных PBMC, обработанных ложным или rVpr. Представленные результаты представляют собой соотношение гибридизации зондов кДНК, полученных из каждого экспериментального образца мРНК, которые были амплифицированы, как описано в (A). Показаны профили экспрессии генов PBMC, уровни РНК которых были затронуты rVpr. Как указано, шкала результатов простирается от коэффициентов гибридизации 0.На чашки помещали от 25 до 4 (от -2 до +2 в единицах логарифма основания 2) мРНК с изменениями.

Рис. 2.

(A) Блок-схема стратегии амплификации аРНК. Подробности в Методах. (B) Иерархическая кластеризация экспрессии гена в первичных PBMC, обработанных ложным или rVpr. Представленные результаты представляют собой соотношение гибридизации зондов кДНК, полученных из каждого экспериментального образца мРНК, которые были амплифицированы, как описано в (A). Показаны профили экспрессии генов PBMC, уровни РНК которых были затронуты rVpr.Как указано, шкала результатов простирается от соотношений гибридизации от 0,25 до 4 (от -2 до +2 в логарифмических единицах основания 2) мРНК с внесенными изменениями.

Эффекты Vpr на экспрессию CD33 и фагоцитоз

Среди сообщений, которые подавлялись с помощью ВИЧ-1 Vpr, мы наблюдали, что CD33 сильно подавляется на уровне РНК. Поглощение антигена происходит через упорядоченный процесс эндоцитоза / фагоцитоза, который начинается с закрепления белков или клеток на поверхности фагоцитарных клеток через специфические рецепторы, включая CD33 и рецептор скавенджера макрофагов (31).Сначала мы попытались подтвердить влияние Vpr на эти важные маркеры. Экспрессию CD33, а также экспрессию класса I и класса II анализировали в клетках, обработанных rVpr, с помощью проточной цитометрии (фиг. 3A). Было влияние на экспрессию HLA класса I и MHC класса II, что может быть маркером иммунной активации. Точно так же экспрессия CD33 на большом подмножестве клеток, обработанных rVpr, также снижалась. Мы предположили, что эффекты Vpr на MHC класса II и CD33 могут влиять на презентацию антигена. Поскольку экспрессия CD33 происходит преимущественно на APC, мы затем исследовали модуляцию Vpr для CD33 на макрофагах / моноцитах, используя CD14 в качестве маркера специфической подгруппы.В этом анализе rVpr подавлял> 80% экспрессии CD33 на CD14-положительных клетках, что свидетельствует о доминирующем влиянии Vpr на этот важный маркер (фиг. 3B). Мы подтвердили влияние Vpr на CD33 с помощью северного и вестерн-блоттинга (рис. 3С). В целом, rVpr сильно снижает экспрессию CD33 в PBMC, предполагая, что некоторые клетки могут быть особенно чувствительны к понижающей модуляции с помощью Vpr.

Рис. 3.

(A) Модуляция CD33, HLA-класса I и MHC-IIDR с помощью rVpr в PBMC.Все PBMC обрабатывали белком rGag или rVpr, как указано. Через 24 часа после обработки фенотип клеточной поверхности обработанных клеток исследовали с помощью анализа FACS с указанными специфическими антителами. Гистограммы показывают указанные поверхностные маркеры, а заполненные гистограммы представляют собой окрашивание контрольных антител, соответствующих изотипу. Аналогичные результаты были получены в трех независимых экспериментах. (B) Анализ проточной цитометрии экспрессии CD33 в моноцитах, обработанных ложным, rGag или rVpr. Очищенные клетки моноцитов собирали через 24 часа после обработки и окрашивали CD14 и специфическим анти-CD33 антителом.Гистограммы показывают экспрессию CD33 в популяции CD14-положительных моноцитов, а заполненные гистограммы представляют собой контрольное окрашивание антител, соответствующее изотипу. Эти эксперименты были повторены трижды, и наблюдались аналогичные наблюдения подавления CD33. (C) Экспрессия CD33 в PBMC, обработанных rVpr. (i) Нозерн-блоттинг мРНК CD33 показывает подавление регуляции под действием rVpr. Суммарную РНК из клеток, обработанных ложным, rGag- или rVpr-белком, экстрагировали через 24 часа после обработки, и 10 мкг общей РНК каждого образца подвергали электрофорезу в 1.2% агарозоформальдегидные гели. Затем гель РНК подвергали блоттингу и переносили на нейлоновую мембрану и гибридизовали с зондом кДНК CD33, как указано в методах. После этого мембрану повторно зондировали GAPDH для сравнения с мРНК домашнего хозяйства. (ii) Вестерн-блоттинг-анализ экспрессии CD33 в PBMC, обработанных rVpr. Образцы обрабатывали, как описано выше, и клетки лизировали, как указано в методах, затем белки разделяли с помощью 12% SDS-PAGE и подвергали блоттингу. Полученные блоты анализировали с использованием mAb против CD33 в качестве специфического зонда или на экспрессию актина с использованием антитела против актина в качестве контроля.Стрелка указывает белок 67 кДа с экспрессией CD33.

Рис. 3.

(A) Модуляция CD33, HLA-класса I и MHC-IIDR с помощью rVpr в PBMC. Все PBMC обрабатывали белком rGag или rVpr, как указано. Через 24 часа после обработки фенотип клеточной поверхности обработанных клеток исследовали с помощью анализа FACS с указанными специфическими антителами. Гистограммы показывают указанные поверхностные маркеры, а заполненные гистограммы представляют собой окрашивание контрольных антител, соответствующих изотипу. Аналогичные результаты были получены в трех независимых экспериментах.(B) Анализ проточной цитометрии экспрессии CD33 в моноцитах, обработанных ложным, rGag или rVpr. Очищенные клетки моноцитов собирали через 24 часа после обработки и окрашивали CD14 и специфическим анти-CD33 антителом. Гистограммы показывают экспрессию CD33 в популяции CD14-положительных моноцитов, а заполненные гистограммы представляют собой контрольное окрашивание антител, соответствующее изотипу. Эти эксперименты были повторены трижды, и наблюдались аналогичные наблюдения подавления CD33. (C) Экспрессия CD33 в PBMC, обработанных rVpr.(i) Нозерн-блоттинг мРНК CD33 показывает подавление регуляции под действием rVpr. Суммарную РНК из клеток, обработанных ложным, rGag- или rVpr-белком, экстрагировали через 24 часа после обработки и 10 мкг общей РНК каждого образца подвергали электрофорезу в 1,2% агарозоформальдегидных гелях. Затем гель РНК подвергали блоттингу и переносили на нейлоновую мембрану и гибридизовали с зондом кДНК CD33, как указано в методах. После этого мембрану повторно зондировали GAPDH для сравнения с мРНК домашнего хозяйства.(ii) Вестерн-блоттинг-анализ экспрессии CD33 в PBMC, обработанных rVpr. Образцы обрабатывали, как описано выше, и клетки лизировали, как указано в методах, затем белки разделяли с помощью 12% SDS-PAGE и подвергали блоттингу. Полученные блоты анализировали с использованием mAb против CD33 в качестве специфического зонда или на экспрессию актина с использованием антитела против актина в качестве контроля. Стрелка указывает белок 67 кДа с экспрессией CD33.

Активация Т-клеток требует процессинга и презентации антигена в контексте молекул MHC профессиональным APC.Поскольку CD33 связывается со многими белками и клетками и экспрессируется на фагоцитарных клетках, мы хотели проверить возможность того, что CD33 опосредует взаимодействие фагоцитарных клеток и влияют ли эти клетки-мишени или белки с помощью Vpr. Сообщалось, что апоптотические тела захватываются профессиональными APC (31). Мы использовали метод проточной цитометрии in vitro для количественной оценки фагоцитарной способности макрофагов, как описано в разделе «Методы». В этом анализе мы очищали Т-клетки и макрофаги по отдельности и индуцировали апоптоз в культивируемых Т-клетках, окрашенных Mitotracker Green (MTG) (рис.4А). Затем апоптозные Т-клетки подвергали воздействию очищенных аутологичных макрофагов, которые предварительно обрабатывали белком rVpr или белком rGag, а затем промывали и повторно культивировали в культуре ткани. Прилипшие макрофаги без апоптотических Т-клеток отрицательны по окрашиванию MTG, в то время как макрофаги, обработанные тельцами апоптических Т-клеток, показывают положительное окрашивание по MTG (21,6%). Этот положительный результат также наблюдался с обработанными rGag контрольными (20,9%) макрофагами. Напротив, макрофаги, обработанные rVpr, имеют дефицит (2.51%) в их способности к фагоцитозу по сравнению с любым из этих контролей. Не было значительной разницы в степени фагоцитоза в нормальных макрофагах (фиг. 4B). Это исследование показывает, что Vpr может нацеливаться на подавление фагоцитоза in vitro и, следовательно, может влиять на презентацию антигена.

Рис. 4.

Фагоцитоз апоптотических Т-клеток адгезивным МДМ. Чистую популяцию CD4 ⁺ Т-клеток и CD14 ⁺-положительный MDM выделяли из всех PBMC, как описано в методах.(A) Т-клетки, обработанные дексаметазоном в течение 6 часов, были положительными по аннексину V (апоптотические клетки), и, кроме того, апоптотические Т-клетки были окрашены MTG. (B) Макрофаги культивировали в 6-луночных планшетах и обрабатывали mock, rGag или rVpr в течение 2 часов. MTG-положительные апоптотические Т-клетки ресуспендировали в RPMI, затем добавляли в планшеты с очищенным MDM, обработанным mock, rGag или rVpr в соотношении 10: 1, и инкубировали в течение 12 часов. После этого клетки промывали RPMI для удаления несвязавшихся Т-клеток. MDM в планшетах промывали PBS, затем ресуспендировали в 200 мкл PBS и анализировали на двойную экспрессию CD14 и MTG, указывающую на фагоцитоз.Гистограммы показывают экспрессию MTG в CD14-положительной популяции MDM, а заполненные гистограммы представляют собой окрашивание контрольных антител, соответствующих изотипу. Эти эксперименты были повторены трижды, и были получены аналогичные результаты.

Рис. 4.

Фагоцитоз апоптотических Т-клеток адгезивным МДМ. Чистую популяцию CD4 ⁺ Т-клеток и CD14 ⁺-положительный MDM выделяли из всех PBMC, как описано в методах. (A) Т-клетки, обработанные дексаметазоном в течение 6 часов, были положительными по аннексину V (апоптотические клетки), и, кроме того, апоптотические Т-клетки были окрашены MTG.(B) Макрофаги культивировали в 6-луночных планшетах и обрабатывали mock, rGag или rVpr в течение 2 часов. MTG-положительные апоптотические Т-клетки ресуспендировали в RPMI, затем добавляли в планшеты с очищенным MDM, обработанным mock, rGag или rVpr в соотношении 10: 1, и инкубировали в течение 12 часов. После этого клетки промывали RPMI для удаления несвязавшихся Т-клеток. MDM в планшетах промывали PBS, затем ресуспендировали в 200 мкл PBS и анализировали на двойную экспрессию CD14 и MTG, указывающую на фагоцитоз. Гистограммы показывают экспрессию MTG в CD14-положительной популяции MDM, а заполненные гистограммы представляют собой окрашивание контрольных антител, соответствующих изотипу.Эти эксперименты были повторены трижды, и были получены аналогичные результаты.

Влияние Vpr на экспрессию костимулирующих молекул в макрофагах и дендритных клетках

Считается, что

DC являются высокоэффективными клетками для презентации антигена, отображаемого MHC, наивным Т-клеткам для индукции первичного иммунного ответа. Важность презентации этого антигена в формировании иммунного ответа была тщательно изучена (1,2). Основываясь на эффектах Vpr на CD33, мы затем попытались изучить эффекты Vpr на костимуляторные молекулы.Для исследования MDM и MDDC были созданы из PBMC, как описано ранее (21,32). Формирование антиген-специфического Т-клеточного иммунного ответа — сложный процесс, который требует взаимодействия Т-клеток с профессиональными APC. APC (включая DC, B-клетки и макрофаги) управляют антиген-специфическими иммунными ответами за счет активации костимулирующих молекул CD40, CD80 и CD86, поскольку они взаимодействуют с T-клетками во время начальных событий активации T-клеток (33–38). Мы исследовали эффекты Vpr на костимуляторные маркеры клеток MDM и MDDC, обработанных 10 пг / мл rVpr.Обработка rVpr специфически снижала экспрессию всех трех важных костимулирующих молекул на MDM, в отличие от обработки контрольным белком rGag (фиг. 5A). Однако не было значительного изменения в уровне экспрессии CD14 ⁺, что позволяет предположить, что Vpr специфически вмешивается в эти костимуляторные молекулы, вывод, который также подтверждается анализом генного чипа. Затем мы исследовали эффекты Vpr на экспрессию костимулирующих молекул в популяции клеток MDDC (рис.5Б). CD80 и CD86, а также маркер созревания и клон-специфический маркер CD83 были понижены в популяции клеток MDDC. Некоторые эффекты Vpr на биологию клетки-хозяина блокируются соединениями против GR, включая RU486 (13,18). Поэтому мы проверили, могут ли эффекты rVpr на модуляцию DC быть отменены RU486, антагонистом GR. В этом исследовании мы обрабатывали DC rVpr в присутствии или в отсутствие RU486 (1 мкМ). В этом анализе RU486 полностью подавлял способность Vpr понижать модуляцию DC, что позволяет предположить, что RU486 возвращает наблюдаемые фенотипы Vpr.Эти данные предполагают, что в макрофагах и DC Vpr может резко влиять на молекулы, важные для индукции иммунного ответа, по крайней мере частично, посредством модуляции GR.

Рис. 5.

(A) Подавление экспрессии костимулирующих молекул в MDM с помощью rVpr. MDM (1 × 10 ⁶ клеток) обрабатывали 10 мкг rGag (тонкие линии) или rVpr (толстые линии). Клетки собирали через 48 часов после обработки и фенотипирование проводили с использованием указанных антител с помощью анализа FACS.Гистограммы показывают указанные поверхностные маркеры для клеток, обработанных как rGag, так и rVpr, а заполненные гистограммы представляют собой окрашивание контрольных антител, соответствующих изотипу. Аналогичные результаты были получены в трех независимых экспериментах. (B и C) Влияние rVpr на экспрессию костимулирующих молекул в DC. Пятидневные зрелые DC обрабатывали 10 мкг rGag или rVpr в присутствии или RU486 (1 мкМ) в течение 72 часов. Равное количество клеток (1 × 10 ⁶) использовали для фенотипического анализа с помощью проточной цитометрии на предмет их экспрессии поверхностных антигенов CD80, CD83 и CD86.Гистограммы показывают указанные поверхностные маркеры, а заполненные гистограммы представляют собой окрашивание контрольных антител, соответствующих изотипу. Похожие результаты были получены в двух независимых экспериментах.

Рис. 5.

Влияние Vpr на дифференцировку моноцитов в DC

Чтобы определить, будет ли Vpr ингибировать изменения созревания DC в отсутствие Т-клеток, мы затем стимулировали незрелые DC (фиг. 6A) TNF-α в присутствии или в отсутствие rVpr. Цитокины (GM-CSF, IL-4 и TNF-α), которые запускают созревание DC (1,21,33), индуцировали сильную активацию костимулирующих молекул CD40, CD80 и CD86, класса главного комплекса гистосовместимости (MHC). II и маркер созревания ДК CD83 (рис.6Б). В присутствии rVpr в концентрации 10 пг / мл / 1 × 10 ⁶ клеток эти цитокин-индуцированные фенотипические изменения резко нарушались (фиг. 6C). Повышающая регуляция CD40, CD80, CD86 и молекул MHC класса I и II в значительной степени ингибировалась, а CD83 вообще не экспрессировался. Важно отметить, что обработанные rVpr DC не возвращались в стадию моноцитов / макрофагов, о чем свидетельствует отсутствие экспрессии CD14 (данные не показаны). Эти эксперименты подтверждают, что Vpr ВИЧ-1 предотвращает фенотипические изменения, вызванные сигналами цитокинов, важными для созревания незрелых DC.

Рис. 6.

Влияние rVpr на созревание постоянного тока. Незрелые DC были получены из PBMC, как описано в Методиках. (A) Свежие незрелые DC ресуспендировали в культуральной среде с добавлением GM-CSF (1000 Ед / мл), IL-4 (500 Ед / мл) и 10 нг / мл TNF-α, и им давали возможность прилипнуть к 6 -луночные планшеты в отсутствие (B) или в присутствии (C) rVpr (10 пг / мл) в течение 7 дней для развития в зрелые DC в течение 7 дней. В день 0 и 7 клетки собирали, промывали и анализировали на поверхностную экспрессию с использованием указанных маркеров с помощью проточной цитометрии.Гистограммы показывают окрашивание специфических поверхностных маркеров, а заполненные гистограммы представляют окрашивание контрольных антител, соответствующих изотипу. Результаты представляют три независимых эксперимента.

Рис. 6.

Влияние rVpr на созревание постоянного тока. Незрелые DC были получены из PBMC, как описано в Методиках. (A) Свежие незрелые DC ресуспендировали в культуральной среде с добавлением GM-CSF (1000 Ед / мл), IL-4 (500 Ед / мл) и 10 нг / мл TNF-α, и им давали возможность прилипнуть к 6 -луночные планшеты в отсутствие (B) или в присутствии (C) rVpr (10 пг / мл) в течение 7 дней для развития в зрелые DC в течение 7 дней.В день 0 и 7 клетки собирали, промывали и анализировали на поверхностную экспрессию с использованием указанных маркеров с помощью проточной цитометрии. Гистограммы показывают окрашивание специфических поверхностных маркеров, а заполненные гистограммы представляют окрашивание контрольных антител, соответствующих изотипу. Результаты представляют три независимых эксперимента.

Ингибирование антиген-специфических ответов Т-лимфоцитов CD4 с помощью Vpr

In vivo Vpr может препятствовать генерации иммунного ответа de novo как у мышей (30), так и у нечеловеческих приматов (39).Механизм (ы), с помощью которого Vpr подавляет эти CD4 ⁺ Т-клеточные ответы, все еще неизвестны. Из приведенных выше результатов ясно, что АРС, обработанные rVpr, дефектны для экспрессии важных костимулирующих молекул, необходимых для презентации антигена. Фактически, презентация антигена в отсутствие костимуляции может привести к истощению реактивных Т-клеток или плохой реакции (34). Чтобы исследовать, может ли АРС, обработанный rVpr, вызывать ингибирующий (иммуномодулирующий) эффект, мы культивировали Т-клетки со смесью предварительно обработанных rVpr или обработанных контрольным белком (rGag) DC.Мы наблюдали, что присутствие всего лишь 12,5% (1/8) или 25% (1/4) ДК, предварительно обработанных rVpr, приводило к 5-10-кратному снижению результирующего иммунного ответа, о чем судили по наклону кривая пролиферативного ответа на 6 день (фиг. 7A). Этот результат заставил нас исследовать, было ли это на самом деле формой анергии Т-клеток. Соответственно, мы попытались рестимулировать Т-клетки, которые были подвергнуты воздействию обработанных rVpr DC или обработанных rGag DC от одного и того же донора, путем удаления обработанных rVpr DC или обработанных rGag DC посредством пэннинга культуры T-клеток / DC с помощью анти-CD83. и анти-CD86 (следовательно, удаление DC).Затем Т-клетки промывали и подтверждали положительную реакцию на маркеры популяции лимфоцитов и отсутствие DC с помощью анализа FACS с использованием специфических маркеров. Эти Т-клетки повторно инкубировали с DC, обработанным импульсом с антигеном, чтобы убедиться в толерантности или отсутствии индуцированной иммуногенности. Результаты показывают, что Т-клетки, подвергшиеся в течение 2 дней воздействию обработанных rVpr DC, не могли пролиферировать при заражении белком rGag (фиг. 7B).

Рис. 7.

Предварительная обработка Vpr вызывает ингибирующий эффект на презентацию антигена.(A) Зрелые DC предварительно обрабатывали либо rGag, либо rVpr (10 мкг) в течение 4 часов. (A) DC, обработанные rVpr или rGag, смешивали в соответствии с соотношением, указанным на рисунке. Градуированные количества каждой смеси и 10 ⁵ очищенных аллогенных Т-клеток высевали в трех экземплярах на 96-луночный круглодонный микротитровальный планшет. (B) Партии из 10 ⁶ зрелых DC обрабатывали либо rGag, либо rVpr (10 пг) в течение 4 часов, промывали и инкубировали с 10 ⁷ алло-лимфоцитами в течение 2 дней. Затем DC удаляли с помощью планшетов, покрытых антителами к CD83 и CD86.Остальные лимфоциты были подтверждены как специфические с использованием маркера CD4 методом проточной цитометрии (внутренняя панель). Все клетки были отрицательными по экспрессии знака DC. Т-клетки разделяли на четыре партии: две партии предварительно инкубировали с DC, обработанными rVpr, и две партии предварительно инкубировали с DC, обработанными rGag. Эти четыре партии лимфоцитов затем снова заражали градуированными дозами зрелых DC (10 ⁶) от того же донора, которые предварительно обрабатывали либо rGag, либо rVpr в течение 4 часов, как указано.(A и B) Пролиферацию определяли на 6 день с использованием анализа поглощения [H ³] тимидина, как указано в методах. Каждая точка представляет собой среднее значение ± SEM из двух отдельных экспериментов. (C) Бесклеточные супернатанты собирали из клеток, обработанных как в (A). Эти культуральные супернатанты анализировали на высвобождение IL-12 и TNF-α с помощью ELISA. Уровни цитокинов (пг / мл) определяли, как описано в Методиках. Показанные данные представляют собой два отдельных эксперимента.

Фиг.7.

Предварительная обработка Vpr вызывает ингибирующий эффект на презентацию антигена. (A) Зрелые DC предварительно обрабатывали либо rGag, либо rVpr (10 мкг) в течение 4 часов. (A) DC, обработанные rVpr или rGag, смешивали в соответствии с соотношением, указанным на рисунке. Градуированные количества каждой смеси и 10 ⁵ очищенных аллогенных Т-клеток высевали в трех экземплярах на 96-луночный круглодонный микротитровальный планшет. (B) Партии из 10 ⁶ зрелых DC обрабатывали либо rGag, либо rVpr (10 пг) в течение 4 часов, промывали и инкубировали с 10 ⁷ алло-лимфоцитами в течение 2 дней.Затем DC удаляли с помощью планшетов, покрытых антителами к CD83 и CD86. Остальные лимфоциты были подтверждены как специфические с использованием маркера CD4 методом проточной цитометрии (внутренняя панель). Все клетки были отрицательными по экспрессии знака DC. Т-клетки разделяли на четыре партии: две партии предварительно инкубировали с DC, обработанными rVpr, и две партии предварительно инкубировали с DC, обработанными rGag. Эти четыре партии лимфоцитов затем снова заражали градуированными дозами зрелых DC (10 ⁶) от того же донора, которые предварительно обрабатывали либо rGag, либо rVpr в течение 4 часов, как указано.(A и B) Пролиферацию определяли на 6 день с использованием анализа поглощения [H ³] тимидина, как указано в методах. Каждая точка представляет собой среднее значение ± SEM из двух отдельных экспериментов. (C) Бесклеточные супернатанты собирали из клеток, обработанных как в (A). Эти культуральные супернатанты анализировали на высвобождение IL-12 и TNF-α с помощью ELISA. Уровни цитокинов (пг / мл) определяли, как описано в Методиках. Показанные данные представляют собой два отдельных эксперимента.

Характер экспрессии цитокинов влияет на природу и устойчивость воспалительного ответа, который играет центральную роль в индукции клеточного иммунитета.Супернатанты из вышеуказанного эксперимента собирали и анализировали с помощью ELISA на продукцию TNF-α и IL-12. Добавление rVpr значительно ингибировало> 3-кратную продукцию воспалительных цитокинов, как измерено в супернатантах этих культур (фиг. 7C). Эти результаты предполагают, что эффекты Vpr на APC могут иметь сильное влияние на активацию и генерацию антиген-специфических Т-клеток. Взятые вместе, эти данные предполагают, что Vpr блокирует обработку и / или представление сигналов APC, которые, вероятно, будут критическими для индукции адаптивного плеча Т-клеточного ответа.

Влияние Vpr как вирион-ассоциированной молекулы на экспрессию костимулирующих молекул

Затем мы попытались подтвердить, может ли Vpr как вирусная молекула влиять на индукцию иммунного ответа аналогичным образом, как это наблюдалось с рекомбинантным белком Vpr. Мы оценили влияние ассоциированной с вирионом молекулы Vpr на экспрессию костимулирующих молекул на APC путем инфицирования макрофагов с использованием вирусов Vpr ⁺ / Vpr ⁺ / Vpr, псевдотипа ВИЧ-1, дополненных VSV.Псевдовирус ВИЧ-1, дополненный VSV, позволяет анализировать однократную репликацию, облегчая анализ действия вирусных белков без последующего распространения вируса. Vpr-положительная вирусная инфекция макрофагов подавляла экспрессию CD40, CD80, CD83 и CD86 по сравнению с неинфицированными или ВИЧ-1 vpr ^— инфицированными вирусом клетками (фиг. 8). Мы показываем, что как вирусный белок Vpr, так и рекомбинантный белок Vpr способны ингибировать созревание APC. Индуцированное вирусами Vpr-индуцированное подавление этих важных молекул подтверждает, что Vpr в контексте инфекции может препятствовать ранним взаимодействиям между инфицированными APC и Т-клетками, необходимым для эффективного иммунного ответа на ВИЧ-1.

Рис. 8.

Влияние Vpr как вирион-ассоциированной молекулы на экспрессию костимулирующих молекул на APC: очищенные макрофаги (4 × 10 ⁶ клеток) были инфицированы оболочкой VSV-G, дополненной ВИЧ-1 vpr ⁺ или ВИЧ-1 vpr ^— вирусов. Через три дня после заражения клетки окрашивали антителами к CD40, CD80, CD83 и CD86, а затем анализировали на поверхностную экспрессию с помощью проточной цитометрии.Гистограммы показывают указанные поверхностные маркеры, а заполненные гистограммы представляют собой окрашивание контрольных антител, соответствующих изотипу. Тонкие линии представляют макрофаги, инфицированные вирусом Vpr ⁺ ВИЧ-1 (Vpr-положительный вирус), а толстые линии представляют макрофаги, инфицированные вирусом ВИЧ-1 vpr ^— (Vpr-отрицательный вирус). Эти эксперименты были повторены с макрофагами, полученными от трех разных доноров, и были получены аналогичные результаты.

Рис. 8.

Влияние Vpr как вирион-ассоциированной молекулы на экспрессию костимулирующих молекул на APC: очищенные макрофаги (4 × 10 ^{6 клеток}) были инфицированы вирусом VSV-G, дополненным оболочкой ВИЧ-1 vpr ⁺ или ВИЧ-1 vpr ^— вирусов.Через три дня после заражения клетки окрашивали антителами к CD40, CD80, CD83 и CD86, а затем анализировали на поверхностную экспрессию с помощью проточной цитометрии. Гистограммы показывают указанные поверхностные маркеры, а заполненные гистограммы представляют собой окрашивание контрольных антител, соответствующих изотипу. Тонкие линии представляют макрофаги, инфицированные вирусом Vpr ⁺ ВИЧ-1 (Vpr-положительный вирус), а толстые линии представляют макрофаги, инфицированные вирусом ВИЧ-1 vpr ^— (Vpr-отрицательный вирус).Эти эксперименты были повторены с макрофагами, полученными от трех разных доноров, и были получены аналогичные результаты.

Обсуждение

Считается, что клеточный иммунитет, в частности, ответы CTL, ограниченные MHC, играют важную роль в защите и избавлении от многих вирусных инфекций. Хотя изначально инфекция ВИЧ-1 контролируется иммунным ответом, иммунная система не может избавиться от вируса и в конечном итоге теряет контроль над виремией из-за неясных механизмов (3,4,40–45).Кроме того, есть свидетельства того, что иммунный ответ хозяина нарушается на ранней стадии ВИЧ-инфекции. Возможным важным игроком в ослабленном иммунном контроле ВИЧ может быть дополнительный антиген ВИЧ Vpr. Vpr ВИЧ-1 оказывает существенное влияние на клеточную пролиферацию, дифференцировку, регуляцию апоптоза, модуляцию продукции цитокинов и подавление опосредованной клеткой-хозяином транскрипции NF-κB (6–14) in vitro . Многие из этих Vpr-опосредованных клеточных событий наблюдались в широком спектре клеточных линий, предполагая, что Vpr нацелен на основные пути эукариотических клеток.Ранее мы и другие показали, что Vpr также оказывает сильное противовоспалительное действие (13,17,18,46,47). Кроме того, совместная иммунизация pVpr с другими антигенами ВИЧ снижает их иммунную активность и ограничивает контроль вакцины над вирусной нагрузкой (39). Следовательно, вполне вероятно, что Vpr может ингибировать клеточный иммунный ответ в условиях ВИЧ-инфекции. Однако потенциальные эффекты Vpr на макрофаги / APC остаются неуловимыми. Например, остается неясным, является ли снижение пролиферации антиген-специфических Т-клеток результатом аберрантной презентации антигена или это прямое воздействие на Т-лимфоциты.Это особенно важно, поскольку считается, что макрофаги и дендритные клетки несут ответственность за транспортировку вируса к Т-клеткам.

В этом исследовании мы исследовали роль Vpr как рекомбинантного белка в активации транскрипции иммунных клеток. Сначала мы исследовали экспрессию генов, регулируемых Vpr, путем обработки PBMC человека очищенным белком rVpr и анализа транскрипции с использованием стандартного анализа микромассивов. Анализ микромассивов показал, что лечение rVpr влияет на молекулы, важные для костимуляции и маркеры иммунологической активации клеток.Эти находки предполагают, что Vpr может мешать функциям постоянного тока или созреванию, или и тем, и другим. Точно так же мы наблюдали, что Vpr влияет на экспрессию антигена CD33. CD33 представляет собой трансмембранный поверхностный белок массой 67 кДа, и его экспрессия специфична для клеток миелоидного клона. Экспрессия CD33 выше в миелоидных клетках-предшественниках и намного ниже в дифференцированных клетках, таких как периферические гранулоциты и тканевые макрофаги. CD33 принадлежит к семейству иммуноглобулиноподобных лектинов. Его внеклеточный домен имеет два иммуноглобулиноподобных домена и связывается с сиаловой кислотой ( N -ацетилнейраминовая кислота), которая присутствует во многих секретируемых или мембранных белках.Его цитоплазматический домен содержит два тирозина, фосфорилирование которых приводит к привлечению молекул, которые подавляют активацию клетки. Из-за наличия сиаловой кислоты во многих секретируемых или мембранных белках и поскольку эти мембранные белки существуют практически во всех типах клеток, потенциально CD33 способен взаимодействовать со многими секретируемыми белками и многими различными клетками (48,49). Эта активность делает CD33, вероятно, важным игроком в презентации антигена. Результаты анализа генного чипа подтверждаются эффектами Vpr на эти важные антигены, как определено анализом потока.Результаты предполагают, что Vpr по-разному модулирует экспрессию CD33 в PBMC по сравнению с популяциями моноцитов / макрофагов. Соответственно, дальнейшее изучение эффектов Vpr на APC будет важным.

Совместное культивирование моноцитов и дендритных клеток с rVpr в сочетании с TNF-α отменяет созревание APC. Этот эффект был полностью обусловлен rVpr, так как добавление антитела против Vpr аннулировало наблюдаемые эффекты Vpr. Потенциальные последствия неудачного созревания APC во время ВИЧ-инфекции могут быть значительными.Например, CD40 функционирует путем взаимодействия с лигандом CD40 (CD40L), экспрессируемым на активированных Т-клетках CD4 ⁺ или CD8 ⁺. Было показано, что взаимодействие CD40L на APC с Т-хелперами или без них «обусловливает» APC для антиген-специфической активации CTL и способствует индукции ответа Т-клеток памяти (35–38,50,51). Следовательно, взаимодействие CD40 с его лигандом становится выгодным для активации CTL во время иммунного ответа. Vpr-опосредованная репрессия CD40 может способствовать неспособности иммунной системы хозяина продолжать эффективный ответ против ВИЧ.

Среди различных костимулирующих молекул были обнаружены молекулы B7 (CD80 и CD86), обеспечивающие мощные иммунные сигналы для активации Т-клеток. Они связываются со своими рецепторами (CD28 / CTLA-4), присутствующими на Т-клетках, сначала активируя, а затем выключая иммунный ответ (33). Молекулы CD80 и CD86 являются поверхностными гликопротеинами и членами суперсемейства иммуноглобулинов, которые экспрессируются только на профессиональных APC (33). Блокирование этих костимулирующих сигналов приводит к отсутствию ответа Т-клеток (31,51).Следовательно, помимо CD40, общее снижение экспрессии B7 может способствовать ослаблению функции APC при ВИЧ-инфекции. Интересно отметить, что аналогичные результаты более низких уровней костимулирующих молекул наблюдались также in vivo в лимфоидных тканях ВИЧ-инфицированных пациентов. Во время острой фазы инфекции сообщалось об увеличении DC с уменьшением CD80 / 86 (37,38). Следовательно, несмотря на эффективную миграцию APC в регионарные лимфатические узлы, эффекты Vpr могут влиять как на презентацию, так и на активацию Т-клеток, тем самым влияя на клиренс вируса.Это уникальное свойство Vpr может обеспечить инфекцию в среде, богатой Т-клетками, без иммунного клиренса и способствовать размножению вируса.

Для того, чтобы выяснить влияние Vpr на активацию Т-клеток, вызывающую дисфункцию APC, мы обработали обработанные rVpr DC белком rGag и измерили пролиферацию Т-клеток и продукцию иммуномодулирующих цитокинов после удаления Vpr через в экспериментах по совместному культивированию in vitro . Наши результаты показывают, что пролиферация Т-клеток и, что более важно, цитокинов сильно уменьшилась в результате обработки DC rVpr.Это указывает на то, что Vpr может влиять на развитие анти-ВИЧ-специфических CTL посредством непрямого подавления функции APC. Предыдущие данные также предполагают, что Т-клетки от бессимптомных ВИЧ-1-положительных людей кажутся нечувствительными и обладают ослабленной способностью продуцировать ИЛ-2. Фактически, было замечено, что дефектное представление Т-клеток может быть ответственным фактором (51). Кроме того, Dybul et al. ранее описали роль передачи сигналов CD40 как механизма стимуляции гипореактивных p24-специфических Т-клеток, предполагая, что аберрантная передача сигналов CD40, вероятно, вносит вклад в индуцированную ВИЧ анергию (52).

В заключение, наши результаты предполагают, что Vpr может влиять на созревание и активацию дендритных клеток / макрофагов in vitro . Этот эффект мог бы in vivo привести к снижению активации Т-клеток и, следовательно, к отсутствию ответов Т-клеток, обеспечивая дополнительный механизм уклонения ВИЧ от иммунной системы хозяина. Вероятно, необходимо дальнейшее изучение этого вопроса.

Мы благодарим доктора Джеймса Эбервина, факультет фармакологии и психиатрии, Медицинский факультет Пенсильванского университета за помощь в проведении анализа кДНК на микромассивах, а также Майкла Дж.Мерве за административную помощь. Мы также выражаем признательность за поддержку со стороны программы NIH AIDS Research and Reference Reagents и CFAR Virology University Пенсильванского университета. Эта работа частично поддерживается грантами DBW от NIH.

Список литературы

1
Bancheraeau, J. and Steinman, R.M.
1998
. Дендритные клетки и контроль иммунитета.
Nature
392
:
245
,2
Cameron, P., Pope, M., Granelli-Piperno, A.and Steinman, R.M.
1996
. Дендритные клетки и репликация ВИЧ-1.
J. Leukoc. Биол.
59
:
158
.3
Куп, Р.А., Сафрит, Дж. Т., Цао, Ю., Эндрюс, Калифорния, Маклеод, Г., Борковски, В., Фартинг, К. и Хо, DD
1994
. Временная ассоциация клеточных иммунных ответов с исходным контролем виремии при синдроме первичного вируса иммунодефицита человека 1 типа.
J. Virol.
68
:
4650
.4
Pantaleo, G. et al.
1994
. Значительное увеличение количества CD8 + Т-клеток с преобладающим использованием V-бета во время первичного иммунного ответа на ВИЧ.
Nature
370
:
463
,5
Ogg, G. S. et al.
1998
. Количественное определение ВИЧ-1-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов и плазменной нагрузки вирусной РНК.
Science
279
:
2103
,6
Re, F., Braaten, D., Franke, E. K. and Luban, J.
1995
.Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 останавливает клеточный цикл в G2, ингибируя активацию p34cdc2-циклина B.
J. Virol.
69
:
6859
,7
Хе, Дж., Чоу, С., Уокер, Р., ДиМарцио, П., Морган, Д. О. и Ландау, Н. Р.
1995
. Вирусный белок R (Vpr) вируса иммунодефицита человека 1 типа задерживает клетки в фазе G2 клеточного цикла, ингибируя активность p34cdc2.
J. Virol.
69
:
6705
,8
Джоуэтт, Дж.Б., Планеллес, В., Пун, Б., Шах, Н. П., Чен, М. Л. и Чен, И. С.
1995
. Ген vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 задерживает инфицированные Т-клетки в фазе G2 + M клеточного цикла.
J. Virol.
69
:
6304
,9
Леви Д. Н., Фернандес Л. С., Уильямс В. В. и Вайнер Д. Б.
1993
. Индукция дифференцировки клеток вирусом иммунодефицита человека 1 впр.
Cell
72
:
541
,10
Стюарт, С.А., Пун, Б., Джоуэтт, Дж. Б. и Чен, И. С.
1997
. Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 индуцирует апоптоз после остановки клеточного цикла.
J. Virol.
71
:
5579
.11
Jacotot, E. et al.
2000
. Вирусный белок R ВИЧ-1 вызывает апоптоз за счет прямого воздействия на поры перехода проницаемости митохондрий.
J. Exp. Med.
191
:
33
.12
Muthumani, K., Hwang, D. S., Десаи, Б. М., Чжан, Д., Дайес, Н., Грин, Д. Р. и Вайнер, Д. Б.
2002
. Vpr ВИЧ-1 индуцирует апоптоз через каспазу 9 в Т-клетках и мононуклеарных клетках периферической крови.
J. Biol. Chem.
277
:
37820
.13
Ayyavoo, V., Mahboubi, A., Mahalingam, S., Ramalingam, R., Kudchodkar, S., Williams, WV, Green, DR and Weiner, DB
1997
. Vpr ВИЧ-1 подавляет активацию иммунной системы и апоптоз за счет регуляции ядерного фактора каппа B.
Nat. Med.
3
:
1117
.14
де Норонья, К. М., Шерман, М. П., Лин, Х. У., Кавруа, М. В., Мойр, Р. Д., Голдман, Р. Д. и Грин, В. К.
2001
. Динамические нарушения в архитектуре и целостности ядерной оболочки, вызванные Vpr ВИЧ-1.
Science
294
:
1105
.15
Heinzinger, N. K. et al.
1994
. Белок Vpr вируса иммунодефицита человека 1 типа влияет на ядерную локализацию вирусных нуклеиновых кислот в неделящихся клетках.
Proc. Natl Acad. Sci. США
91
:
7311
,16
Рафаэли Ю., Леви Д. Н. и Вайнер Д. Б.
1995
. Комплекс глюкокортикоидных рецепторов типа II является мишенью продукта гена vpr ВИЧ-1.
Proc. Natl Acad. Sci. США
92
:
3621
,17
Мутумани К., Кудходкар С., Папасаввас С. Э., Монтанер Л. Дж., Вайнер Д. Б. и Айяву В.
2000
. Vpr ВИЧ-1 регулирует экспрессию бета-хемокинов в первичных лимфоцитах и макрофагах человека.
J. Leukoc. Биол.
68
:
366
. 18
Мирани, М., Еленков, И., Вольпи, С., Хирои, Н., Хрусос, Г. П. и Кино, Т.
2002
. Белок Vpr ВИЧ-1 подавляет продукцию IL-12 моноцитами человека за счет усиления действия глюкокортикоидов: потенциальные последствия активности коактиватора Vpr для врожденного и клеточного иммунитета, наблюдаемого при ВИЧ-1-инфекции.
J. Immunol.
169
:
6361
.19
Леви Д. Н., Рефали Ю., МакГрегор Р. и Вайнер Д. Б.
1994
. Сыворотка Vpr регулирует продуктивную инфекцию и латентный период вируса иммунодефицита человека типа 1.
Proc. Natl Acad. Sci. USA
91
:
10873
.20
Шерман, М. П., Шуберт, У., Уильямс, С. А., де Норонья, К. М., Крейсберг, Дж. Ф., Хенкляйн, П. и Грин, В. К.
2002
. ВИЧ-1 Vpr проявляет естественные белковые трансдуцирующие свойства: значение для вирусного патогенеза.
Вирусология
302
:
95
.21
Romani, N. et al.
1994
. Пролиферирующие предшественники дендритных клеток в крови человека.
J. Exp. Med.
180
:
83
.22
Патель, К. А., Мухтар, М. и Померанц, Р. Дж.
2000
. Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 индуцирует апоптоз в нейрональных клетках человека.
J. Virol.
74
:
9717
,23
Качармина Дж. Э., Крино П. Б. и Эбервин Дж.
1999
. Получение кДНК из отдельных клеток и субклеточных областей.
Meth. Энзимол.
303
:
3
.24
Эйзен, М. Б., Спеллман, П. Т., Браун, П. О. и Ботштейн, Д.
1998
. Кластерный анализ и отображение паттернов экспрессии в масштабе всего генома.
Proc. Natl Acad. Sci. США
95
:
14863
,25
Сэмбрук Дж., Фрич Э. Ф. и Маниатис Т.
1989
. Молекулярное клонирование. Лабораторное руководство. 2-е изд. . Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор. Колд-Спринг-Харбор, штат Нью-Йорк.п. 7.37.26
Ходж С., Ходж Г., Шикчитано Р., Рейнольдс П. Н. и Холмс М.
2003
. Альвеолярные макрофаги от субъектов с хронической обструктивной болезнью легких обладают недостаточной способностью фагоцитировать апоптозные эпителиальные клетки дыхательных путей.
Immunol. Cell Biol.
81
:
289
,27
Каларота, С.А., Отеро, М., Херманстейн, К., Льюис, М., Розати, М., Фелбер, Б.К., Павлакис, Г.Н., Бойер, Д.Д. и Вайнер, Д.Б.
2003
.Использование интерлейкина 15 для увеличения продукции гамма-интерферона антиген-специфическими стимулированными лимфоцитами макак-резусов.
J. Immunol. Meth.
279
:
55
,28
Леви Д. Н., Рафаэли Ю. и Вайнер Д. Б.
1995
. Внеклеточный белок Vpr увеличивает клеточную проницаемость для репликации вируса иммунодефицита человека и реактивирует вирус с латентного периода.
J. Virol.
69
:
1243
,29
Стюарт С.А., Пун Б., Джоветт, Дж. Б. М., Се, Ю. и Чен, И. С.
1999
. Лентивирусная доставка белка Vpr ВИЧ-1 вызывает апоптоз в трансформированных клетках.
Proc. Natl Aacd. Sci. США
96
:
12039
.30
Ayyavoo, V. et al.
2002
. Вирусный белок R ВИЧ-1 нарушает клеточную иммунную функцию in vivo .
Int Immunol.
14
:
13
.31
Харшайн, Л. А., Циммер, М. И., Гамботто, А. и Баррат-Бойз, С.М.
2001
. Роль рецептора мусорщика класса А в отщеплении дендритных клеток от живых клеток.
J. Immunol.
170
:
2302
.32
Гейссман, Ф., Прост, К., Моне, Дж. П., Дай, М., Брус, Н. и Эрмин, О.
1998
. Трансформирующий фактор роста бета1 в присутствии колониестимулирующего фактора гранулоцитов / макрофагов и интерлейкина 4 индуцирует дифференцировку моноцитов периферической крови человека в дендритные клетки Лангерганса.
Дж.Exp. Med.
187
:
961
.33
Шарп, А. Х. и Фриман, Г. Дж.
2002
. Суперсемейство B7-CD28.
Nat. Rev. Immunol.
2
:
116
. 34
Harding, F. A., McArthur, J. G., Gross, J. A., Raulet, D. H. and Allison, J. P.
1992
. CD28-опосредованная передача сигналов костимулирует мышиные Т-клетки и предотвращает индукцию анергии в клонах Т-клеток.
Nature
356
:
607
,35
Bennett, S.Р., Карбоне, Ф. Р., Карамалис, Ф., Флавелл, Р. А., Миллер, Дж. Ф. и Хит, В. Р.
1998
. Помощь в ответах цитотоксических Т-клеток обеспечивается передачей сигналов CD40.
Nature
393
:
478
,36
Шенбергер, С. П., Тус, Р. Э., ван дер Вурт, Э. И., Оффринга, Р. и Мелиф, К. Дж.
1998
. Т-клеточная помощь цитотоксическим Т-лимфоцитам опосредуется взаимодействиями CD40 – CD40L.
Природа
393
:
480
.37
Лор, К. и др. .
2002
. Накопление дендритных клеток DC-SIGN + CD40 + со сниженной экспрессией CD80 и CD86 в лимфоидной ткани во время острой инфекции ВИЧ-1.
AIDS
16
:
683
.38
Гимми, К. Д., Фриман, Г. Дж., Гриббен, Дж. Г., Грей, Г. и Надлер, Л. М.
1993
. Клональная анергия Т-клеток человека индуцируется презентацией антигена в отсутствие костимуляции B7.
Proc. Natl Acad. Sci. США
90
:
6586
–90.39
Muthumani, K. et al.
2002
. Включение дополнительного гена Vpr в коктейль плазмидной вакцины заметно снижает эффективность вакцины Nef in vivo , что приводит к потере клеток CD4 и увеличению вирусной нагрузки у макак-резусов.
J. Med. Primatol.
31
:
179
.40
Летвин Н. Л. и Уокер Б. Д.
2003
. Иммунопатогенез и иммунотерапия при вирусных инфекциях СПИДа.
Nat. Med.
9
:
861
.41
Летвин Н. Л., Баруш Д. Х. и Монтефиори Д. К.
2002
. Перспективы вакцинной защиты от инфекции ВИЧ-1 и СПИДа.
Annu. Rev. Immunol.
20
:
73
.42
Никл, Д. К., Дженсен, М. А., Готтлиб, Г. С., Шрайнер, Д., Джидж, Г. Х., Родриго, А. Г. и Маллинс, Дж. И.
2003
. Консенсусные вакцины против ВИЧ и вакцины от предков.
Наука
7
:
1515
.43
Fauci, A. S.
1996
.Факторы хозяина и патогенез ВИЧ-индуцированного заболевания.
Nature
384
:
529
.44
Barouch, D. H. et al. .
2000
. Контроль виремии и профилактика клинического СПИДа у макак-резусов путем вакцинации ДНК с добавлением цитокинов.
Science
290
:
486
.45
Piguet, V. and Trono, D.
2001
. Жизнь в забвении: уклонение от иммунитета к ВИЧ.
Семин. Иммунол.
13
:
51
.46
Мутумани К., Десаи, Б. М., Хван, Д. С., Чу, А. Ю., Лэдди, Д. Дж., Тхиеу, К. П., Рао, Р. Г. и Вайнер, Д. Б.
2004
. ВИЧ-1 Vpr и противовоспалительная активность.
ДНК Cell Biol.
23
:
239
.47
Кино, Т., Грагеров, А., Копп, Дж. Б., Стаубер, Р. Х., Павлакис, Г. Н. и Хрусос, Г. П.,
1999
. Связанный с вирионом ВИЧ-1 белок Vpr является коактиватором рецептора глюкокортикоидов человека.
J. Exp. Med.
189
:
51
.48
Корниш, А. Л. et al.
1998
. Характеристика сиглека-5, нового гликопротеина, экспрессируемого на миелоидных клетках, связанных с CD33.
Кровь
92
:
2123
.49
Whitney, G., Wang, S., Chang, H., Cheng, KY, Lu, P., Zhou, XD, Yang, WP, McKinnon, M. and Лонгфр, М.
2001
. Новый член семейства сиглеков, сиглек-10, экспрессируется в клетках иммунной системы и обладает сигнальными свойствами, подобными CD33.
евро.J. Biochem.
268
:
6083
.50
Ридж, Дж. П., ДиРоза, Ф. и Матцингер, П.
1998
. Условная дендритная клетка может быть временным мостом между CD4 + T-хелпером и T-киллером.
Nature
393
:
474
.51
Meyaard, L., Schuitemaker, H. and Miedema, F.
1993
. Дисфункция Т-клеток при ВИЧ-инфекции: анаергия из-за нарушения функции антигенпрезентирующих клеток?
Immunol. Сегодня
14
:
161
.